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原位杂交技术和操作步骤详细介绍
原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
多种探针标记检测系统
基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。
荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择
DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：
原位杂交检测步骤
原位杂交涉及的步骤 ：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1.玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片， 1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2.样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液 (pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 C30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5& min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3.探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4.原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃ 10min。
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+& 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours
杂交后的洗涤
杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的 2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5.免疫细胞化学反应 (报告分子标记的探针)
如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween 20 和BSA的 PBS中进行封闭。
&如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl将有助于防止背景染色。封闭后再 进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C& 30 min孵育 (或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5C10 min的洗涤。
酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。
6.显微镜检测
POD和AP的底物显色反应后使用普通的显微镜镜检，且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。对于样品厚度较高或密度较大的情况，可使用相差显微镜进行镜检。
如使用荧光标记的探针，则在杂交和洗涤步骤后直接用荧光显微镜观察。荧光探针配合荧光显微镜的检测是进行多重探针检测的良好手段，检测时建议使用抗荧光衰减封片剂，以减缓荧光淬灭。DNA复染用的PI或DAPI可直接溶于封片液进行染色(40 ng DAPI/ 100 ng PI/ml) 。
原位杂交实验文献参考：
该文献对组织切片和FFPE样品的原位杂交检测步骤进行了详尽的探索和优化，简化了实验的操作步骤，并能在复杂样品的杂交实验中原位检测到低拷贝的靶mRNA表达（20~30拷贝/细胞） 。（link to 文章2）
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cRNA原位杂交探针
最近在做原位杂交的探针，自己用试剂盒合成的cRNA探针240bp左右，但是电泳之后发现，从上样孔一直到240bp出都有弥散，想请问是什么原因，这样的探针还能用吗？
上样前将探针在80度水浴中处理5分钟，冰浴。电泳时间5-10分钟，弥散的情况会好转。另，RNA探针本来就有点弥散，不碍事的。 : Originally posted by lixg at
上样前将探针在80度水浴中处理5分钟，冰浴。电泳时间5-10分钟，弥散的情况会好转。另，RNA探针本来就有点弥散，不碍事的。 再请教个问题，做原位杂交实验，一些塑料盒东西用氯仿泡的，之后要用酒精和DEPC处理水洗掉吗？能处理干净吗？ 原位杂交中在探针收集后和半定量之前加入的tRNA是不是酵母RNA ？？？ 这个怎么弄 : Originally posted by lixg at
上样前将探针在80度水浴中处理5分钟，冰浴。电泳时间5-10分钟，弥散的情况会好转。另，RNA探针本来就有点弥散，不碍事的。 你好，做过RNA探针和中期染色体的杂交么?这和DNA与DNA杂交有什么条件上的要求么？ : Originally posted by hongdou at
再请教个问题，做原位杂交实验，一些塑料盒东西用氯仿泡的，之后要用酒精和DEPC处理水洗掉吗？能处理干净吗？... 氯仿泡过的直接晾干即可
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原位核酸分子杂交技术
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ
hybridization)，是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段。使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具，视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(gene mapping)，转基因检测，基因表达定位(localization of
gene expression) ,核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of
mRNA)，复制(replication)和细胞的分类(sorting of
cells)。临床应用在细胞遗传学(cytogenetics)，产前诊断(prenatal
diagnosis)，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定(biological
dosimetry)和病毒学的病源学诊断等。
一、原位核酸分子杂交技术的发展
原位杂交1969年由美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buogiorno-Nardelli和Amaldi，John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Ortho（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cDNA探针在兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。
由于同位素标记探针具有放射性，既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，因此研究用非放射性标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起许多学者的重视和探索。Bauman（1981）等首先用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得了成功。Shroyer(1982)报导用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。
Brigat(1983)首先创立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学诊断中。Boeringer-MannhemBiochemisca(Roche)于1987年将地高辛标记的有关试剂和药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记要优越，地高辛标记法显示的颜色为蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。
二、原位分子杂交技术的基本方法
基本方法包括：1.杂交前准备：包括固定、取材、玻片和组织的处理，增强核酸探针的穿通性和减低背景染色等；2. 杂交；3.
杂交后处理；4. 显示：包括放射性自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。（一）、固定
固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针容易进入细胞或组织。DNA比较稳定，mRNA易被酶降解。所以取材后应尽快冰冻或固定。
1.最常用多聚甲醛固定液，因其不会与广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。
2.mRNA原位杂交时应将组织固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中1-2h，在冰冻前浸入15％蔗糖中4℃过夜，次日切片或保存于液氮中。
3.组织也可在取材后直接置于液氮中冷冻，切片后将其浸入4％多聚甲醛约10min空气中干燥后保存于-70℃，可保存数月。
4.福尔马林固定、石蜡包埋的切片对检测DNA或mRNA有时也可获得杂交信号，但由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时在包埋的过程中可减低mRNA的含量
（二）、玻片和组织切片的处理
玻片的处理：洗涤剂浸泡，清水冲洗；弱酸中浸泡，冲洗；酒精中浸泡，冲洗，最后蒸馏水冲洗，烘干，高热灭菌。粘附剂涂片：有三种：
铬矾-明胶液；
多聚赖氨酸（Poly－L－Lysine）；
APES(3-amino propyltriethoxysalane，氨丙基三乙氧基硅烷)。
一般2％APES丙酮液中浸泡10秒，然后丙酮中洗1分钟。
2. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
常用的方法：应用稀释的酸洗涤；去垢剂(detergent)或称清洗剂，如Triton-X
100或某些消化酶，如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。注意不要过度。蛋白酶K(proteinaseK)的消化作用的浓度及孵时间视组织种类、应用固定剂的种类、切片的厚薄而定。一般应用1μg/ml（于0.1mol/L
Tris-50mmol/L EDTA，pH8.0中），在37℃下孵育15-20分钟。
3. 减低背景染色：杂交后的酶处理和洗涤均有助于减低背景颜色。在多聚甲醛固定后浸入乙酸酐(acetic
anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交是减低背景染色的一种有效手段，预杂交液与杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖(dextransulphate)，可达到封闭非特异性的杂交目的，减低背景染色。在杂交后洗涤中用低浓度的RNA酶溶液（201μg/ml）洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA，减低背景染色。
4. 防止RNARNA酶的污染：整个实验过程戴消毒手套，器具高温消毒（240℃）。溶液配制用DEPC水。
（三）、杂交：
杂交(hybridization)是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，防止孵育过程中杂交液的蒸发。切片放于5&SSC或2&SSC溶液的湿盒中进行孵育。SSC：(standard
saline citrate)
（四）、杂交后处理： 不同温度，不同盐浓度的漂洗。一般的原则是盐溶液浓度由高到低而温度由高到低。注意漂洗过程中切勿干燥。
（五）、显示（检测系统） 前述
（六）、对照实验和结果的判定
1.1.将cDNA与cRNA探针进行杂交（吸收实验）
2.2.与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换实验）
3.3.将切片用RNA酶或DNA酶进行预处理后进行杂交，用同义探针(sense probe)进行杂交。
4.4.以不中核酸探针杂交液进行杂交（空白实验）。
5.5.组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。
6.用未标记探针杂交，进行对照。
（二）、 RNARNA探针
1. cRNAcRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录获得。
2. 寡核苷酸探针：以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成。
1. 酶反应法：末端标记法，将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一种标记法，一般携带的标记分子较少。
体外转录法：是一种与克隆片段序列相同的单RNA探针的方法。先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不转录。如大肠村菌噬菌体T3，T7，SP6。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将持粒线性化，在4
种三磷酸核糖核苷的相应的噬菌体RNA聚合酶的存在下，即转录成RNA。如反应物中有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA易被标记。常用的非放射性标记技术有：生物素、地高辛（DIG）、碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）和荧光素。
图9--2 用噬菌体编码的RNARNA聚合酶体外合成RNARNA
将待转录的DNA片段克隆入多克隆位点区的限制性位点中，多克隆位点的两侧带有两个噬菌体聚合酶启动子（通常为T7和SP6）。用可切割转录区下游的限制性内切核酸酶酶切使DNA线性化，以防止环状模板DNA多聚转录物的合成。将适当的聚合酶及rNTP加入适宜的缓冲液时，即可从靠近插入物的启动子开始转录。互补于一条模板链的RNA产物的长度与转录的启动子及线性DNA至靶序列末端之间的距离相等。反应结束时，用无RNA酶的DNA酶消化除去DNA模板，DNA酶消化后产生的未掺入的核苷酸和寡脱氧核着酸可通过SephadexG-75层析除去。
纯化： 为了去除在探针标记过程中未被标记的剩余dNTP等小分子，常用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。
1. 乙醇沉淀法的原理：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清中，由些反复乙醇沉淀能将两者分开。
2. 酚/氯仿抽提法： 交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，能将溶液中的蛋白质除去。
RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进行入细胞，杂交率高，杂交时间短。合成长的探针需要水解成短的探针。
40mM NaHCO3+60mM Na2CO3
7M NH4OAc+EtoH
时间： 温度： ;℃
T = ───────
K= 0.11 kb/min
Lf:原检测基因的长度（已合成的探针的长度）kb
Lo:要水解的探针的长度kb
BCL-2 ISH Detection Kit
BCL BCL－－2原位杂交检测试剂盒使用说明书
产品编号：HK1050 保存：置4℃
工作量：100张切片有效期：一年
BCL-2是主要的抗凋亡基因。本试剂盒采用针对人、大鼠、小鼠的BCL-2特异性寡核苷酸探针，经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法，具有敏感性特别高，背景清晰，结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定，石蜡包埋标本的BCL-2
mRNA序列。
针对人的 BCLBCL-22的寡核苷酸探针序列：
5’TGCGA CAGCT TATAA TGGAT GTACT TCATC3’；
5’GTGAA GGGCG TCAGG TGCAG CTGGC TGGAC3’；
5’AGGTG CCGGT TCAGG TACTC AGTCA TCCAC3’。
上述序列和大鼠、小鼠的序列仅3bp/90bp不同。兔和人序列基本相同。
适用种属 : 人、大鼠、免、小鼠组织。
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶（&10；Pepsin）2ml；
2. 预杂交液2ml；
3. BCL-2寡核苷酸探针杂交液2ml；
4. 封闭液5ml；
5. 生物素化鼠抗地高辛5ml；
6. SABC-POD 5ml；
7. 生物素化过氧化物酶5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片（博士德有售）：POLY－L－LYSINE；DEPC；20%甘油缓冲液（3%柠檬酸，1&SSC，0.5&SSC,
0.2&SSC, 0.5MPBS）
一、培养细胞和冰冻切片
准备工作： 缓冲液的配备
33％柠檬酸：％：100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7&H2O）3g，pH 2.0左右。
22&&SSCSSC：：1000ml蒸馏水中加氢化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3&2H2O，分子量294）8.8g。
0.50.5&&SSCSSC：：300ml蒸馏水加100ml 2&SSC即可。
0.20.2&&SSCSSC：：270ml蒸馏水加30ml 3&SSC即可。
2020％甘油：％：20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
0.50.5M PBSM PBS：：1000ml蒸馏水加氯化钠30g，Na2HPO4&12H2O 6g，NaH2PO4&2H2O
0.4g，pH7.2-7.6。
操作程序： 注意：
最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1％的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度20μm。
2.2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5％的CO2，所用培养基为Dubecco基础培养基。细胞长好后0.1M
PBS（pH 7.4）洗2分钟&3次。
3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4％多聚甲醛／0.1M PBS（pH 7.2-7.4），含有1／1000
DEPC。室温固定30-60分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4. 新鲜配制0.5％H2O2／甲醇室温处理30分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤3次。
5. 暴露mRNAmRNA核酸片段：切片上摘加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml
3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化30-120秒钟。有时也可以不消化。0.5M
PBS洗3次&5分钟。蒸馏水洗1次。
6. 预杂交：湿盒的准备：干的杂交盒底部加20％甘油20ml以保持湿度。按每张切片加20
μl预杂交液。恒温箱37-40℃24小时。吸取多余液体，不洗。
7. 杂交：按每张切片20μl杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱40-42℃杂交过夜。
9. 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。
10. 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分钟或20℃左右120分钟。05M
PBS洗5分钟&4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11. 滴加SABCSABC：：37℃20分钟或20℃左右30分钟。0.5M
PBS洗5分钟&3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12. 滴加生物素化过氧化物酶：37&#℃左右30分钟。0.5M PBS洗5分钟&4次。
显色::使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
14. 必要时苏木素更染，充分水洗。
15. 酒精脱水，二甲苯透明，封片。
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鲤45s rdna的染色体荧光原位杂交定位
chromosomal localization of 45s rdna in comm.
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chromosomal localization of 45s rdna in common carp by fluorescence in situ hybridization
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