作者：赵四海，郑华东1，楚雍烈，林燕，张春芳，陈正兰，朱虹，杨鹏辉，刘恩岐

囊膜穿刺方法将输卵管和腹壁的炎性黏连发生率由60%降低到了20%，减轻了对移植后胚胎存活的不利影响，将ICR小鼠和C57BL/6小鼠胚胎移植成功率分别提高到了61%和37%. 结论： 通过囊膜穿刺进行胚胎移植提高了胚胎移植成功率.
　　【关键词】 胚胎移植；囊膜；小鼠；成功率
　　1980年，Gordon等［1］首次利用显微注射方法制作成功转基因小鼠. 此后，转基因小鼠逐渐成为生物医学研究中重要的实验动物模型［2-3］. 胚胎移植技术是制作转基因动物的关键技术之一，提高胚胎移植成功率的研究对提高转基因动物的制作效率具有重要意义. C57BL /6小鼠是国际通用的标准近交系小鼠，ICR小鼠也是国内进行转基因研究的常用品系. 我们选用这两种品系小鼠对改进的经囊膜穿刺胚胎移植术和传统的撕破囊膜移植术进行了比较研究.
　　1.1材料 ICR和C57BL/6小鼠（西安交通大学实验动物中心）. 所有实验用小鼠均在SPF动物房饲养，温度控制在(22±3)℃，光控(12 h明/12 h暗)，自由采食. Co60灭菌饲料（第四军医大学实验动物中心）；孕马血清(PMS，宁波激素厂）；绒毛膜促性腺激素 (hCG，宁波激素厂）；透明质酸酶（美国Sigma公司）；M2和M16培养液均为自制；CO2培养箱（美国Shel lab公司）；体视显微镜（日本Nikon公司）；显微手术器械.
　　1.2.1胚胎移植术前准备［4］
　　1.2.1.1超数排卵和同期发情用PMS和hCG诱发供体雌鼠同期发情和超数排卵. 在实验第1日腹腔注射PMS(0.5 U/只)，46~48 h后给供体鼠注射hCG（0.5 U/只），hCG注射当日（实验第3日）下午和雄鼠合笼，次日6:30~8:00检查雌鼠有无阴栓以判定是否已经交配.
　　1.2.1.2受体鼠的准备实验开始前提前准备输精管结扎雄鼠，挑选至少两次和雌鼠交配后都不能使其受孕的结扎雄鼠备用. 实验第3日下午合笼受体鼠和结扎雄鼠，次日06:30～08:00检查雌鼠有无阴栓以判断是否已经交配，交配成功的雌鼠作为胚胎移植的受体鼠.
　　1.2.1.3受精卵的收集处死供体鼠，打开腹腔，取出输卵管（保留一小段子宫）. 将输卵管置于M2培养液中，用小镊子撕开输卵管膨大部，可见有卵团溢出，用吸管［5-6］将卵团转移至含有透明质酸酶的M2培养液滴中，吹吸数次，洗掉卵细胞周围的泡沫细胞. 将受精卵转移至含有M16培养液滴的培养皿中，37℃, 50 mL/L CO2培养箱内短暂培养.
　　1.2.2胚胎移植方法将106只受体雌鼠随机分为两组，其中一组（59只）采用传统的胚胎移植方法［4］；另一组（47只）采用改进的胚胎移植方法，手术方式如图1所示.
　　图1胚胎移植不同术式比较　略
　　1.2.2.1传统的胚胎移植方法［4］用水合氯醛麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后一根肋骨水平切1 cm左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫. 用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用，以防输卵管缩回体腔. 用移卵管吸15～20个受精卵准备移植. 将小鼠转到解剖镜下仔细寻找到输卵管. 可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部（图1 A）.
　　1.2.2.2改进的胚胎移植方法麻醉及手术区域暴露同上，但在胚胎移植囊膜处理时不同. 先用吸卵管在囊膜无或少血管分布处穿一小洞（也可先用大头针针头穿），再将吸卵管通过囊膜上的小洞轻轻送进输卵管口，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部（图1 B）.
　　统计学处理： 数据采用 SPSS11.5 统计软件进行分析，根据资料类型分别采用t检验和χ2检验，以P<0.05 为差别有统计学意义（双侧）.

　　2.1胚胎移植术改进前后ICR小鼠胚胎移植成功率比较ICR小鼠在改进胚胎移植术式后比传统的胚胎移植技术在成功率上有较大的提高，统计学比较有显著差异（P<0.01，表1）.

　　表1ICR小鼠和C57BL/6小鼠不同术式后胚胎移植成功率比较（略）

　　2.2胚胎移植术改进前后C57BL/6鼠胚胎移植成功率比较C57BL/6小鼠的改进胚胎移植术式比传统胚胎移植技术的成功率有较大提高（表1），但统计学差异不显著.

　　2.3不同术式后未怀孕受体鼠手术部位和腹壁黏连发生率比较对部分未怀孕的受体鼠进行解剖发现，传统术式容易引起手术部位的黏连，而改进胚胎移植方法后，黏连的发生率显著降低（P<0.05，表2）.
　　表2不同术式后未怀孕受体鼠手术部位和腹壁黏连发生率比较（略）

　　2.4品系对胚胎移植成功率的影响改进胚胎移植术式后ICR小鼠胚胎移植成功率高于C57BL/6小鼠（表1）.
　　胚胎移植是转基因动物制作过程中的重要技术之一，影响胚胎移植成功的因素有很多［7］. 要提高胚胎移植成功率除了加强专门技术训练，还可以对原有技术进行改进.
　　囊膜是从卵巢垂下包裹着输卵管的一层较为透明的膜状结构，在输卵管收集卵巢排出的卵子方面可能具有辅助作用. 囊膜毛细血管的分布较为丰富，传统的胚胎移植术在撕破囊膜时完全避开血管是比较困难的. 囊膜是透明的，可以用吸卵管或细的大头针针头在无血管分布处穿一个小口，让移卵管通过这个小口进入输卵管伞部移植受精卵. 这样降低了对囊膜的机械损伤，可以减少出血，降低输卵管部位术后跟腹壁的炎性黏连，而减少手术出血及术后继发的炎症黏连是手术成功的重要保证. 因此，我们在胚胎移植时采用改进的经囊膜穿刺胚胎移植术避免了传统手术方式的撕破囊膜，达到了降低术中出血的可能性和术后炎症引起的输卵管手术部位和腹壁的黏连. 最终实验结果也表明，改进的经囊膜穿刺胚胎移植术提高了胚胎移植成功率.
　　小鼠品系也是影响胚胎移植成功率的重要因素之一［7-8］. 实验中我们也发现ICR小鼠胚胎移植成功率要优于C57BL/6小鼠，但是产仔数量并不比C57BL/6多. 改进胚胎移植术后，C57BL/6小鼠的胚胎移植成功率也有所升高，但统计学差异不显著，可能与我们统计样本较少有关.

　　［2］ 刘恩岐，尹海林，薛智谋，等. 医学实验动物学［M］.  北京：人民卫生出版社，2004：10-14.

　　［3］ 赵四海，郑华东，刘恩岐. 生物医学研究中实验动物的应用状况与分析［J］. 中国比较医学杂志, 2006,16（4）：245-248.

　　［5］ 刘恩岐, 杨鹏辉, 林，等. 小鼠胚胎吸管的改进 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)，2002，23(6)：609-610.

　　［7］ 吴红，朱孝荣，孙强，等. 影响小鼠1细胞期胚胎移植成功率有关因素的探讨 ［J］. 实验动物科学与管理，2002，19（1）：49-51.

　　［8］ 张庆玲, 贺莉, 杨玉芳, 等. 小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究［J］. 第四军医大学学报, 2006，27（14）：.

技术已经以前所未有的精度、效率和易用性改变了小鼠基因组编辑。

然而，目前将CRISPR试剂微注射到原核阶段胚胎的工作速率仍然是受限制的。

我们开发了核糖核蛋白（RNP）电穿孔受精卵（CyrPRE-EZ）技术，该技术以电穿孔为基础，在效率，简单性，成本和产量等方面优于原核和细胞质。

通过将预组装的Cas9/sgRNA RNPs导入原核阶段胚胎，快速且瞬时地进行编辑，最大限度地提高效率，同时最小化镶嵌性。

CRISPR-EZ通过使用一系列电脉冲，完全绕过微注射，以100%的效率递送RNPs。

CRISPR-EZ大大超过了CAS9mRNA /sgRNA微量注射的编辑效率，约为成本的四分之一。

在高通量基因敲除小鼠项目（KOMP）系列的并列比较中，CRISPR-EZ始终优于微注射。

我们提供了一个优化的协议涵盖sgRNA合成，胚胎收集，RNP电穿孔，小鼠的产生，和基因分型策略。

CRISPR-EZ使用通常可用的试剂和设备，只需要基本的胚胎处理技能，并且已经通过广泛的靶标和编辑方案进行了全面测试，使得我们的协议容易适应许多研究者。

CRISPR-EZ是一种强有力的工具，它代替了显微注射作为最常用的编辑方案的标准小鼠基因组编辑方法。

使用CRISPR-EZ，一个具有基本胚胎操作技能的研究生水平的研究者可以在6周内获得转基因小鼠。

总之，CRISPR-EZ是一种简单、经济、高效和高通量的技术，可潜在地应用于其他哺乳动物物种。

使用CRISPR-EZ，可以在1至2周内快速地在培养的小鼠胚胎中直接检测sGRNAS，随后在1个月内产生编辑过的小鼠（图1B）。

该协议可分为七个主要阶段，包括：

sgRNA设计（步骤1和2）；

超数排卵和交配（步骤16～19）；

胚胎培养、收集和处理（步骤20～28）；

RNP组装和电穿孔（步骤29～34）；

胚胎培养和基因型分型（步骤35a）

输卵管转移（步骤35b）。

　　作者：南方周末记者 黄永明 南方周末特约撰稿 伟尧　

　　CRISPR技术的迅猛发展使得“定制婴儿”等问题比任何时候都更加迫在眉睫。对特定人群进行永久性的基因“强化”可能会导致社会不公，也有可能被强制使用。

　　这是一项可以与气候变化相提并论的争论。它所涉及的技术可能会治愈包括抑郁症和艾滋病在内的多种重大疾病，但它却也让人担心会给人类带来一场前所未有的灾难。这项技术叫做“基因编辑”。

　　基因编辑技术，或者更确切地说，规律成簇的间隔短回文重复（简称“CRISPR”），其基本原理来自细菌对抗病毒的一种机制。它被证明能够用于人类细胞仅仅是三年前的事，但它发展迅猛，就连这个领域中的科学家都感到跟上最新进展是一件吃力的事情。

　　2015年12月初，世界上基因研究领域的顶尖学者聚集在华盛顿，召开了为期三天的人类基因编辑国际峰会。会议上，学者们探讨了“基因编辑”这项革命性技术带来的科学、伦理和监管问题。这让基因编辑在短短八个月之内第三次成为国际热点话题。

　　稍早的时候，2015年4月，中山大学的生物学家宣布首次对人类胚胎进行了基因组修改，这引起科学界的轩然大波。

　　10月，联合国教科文组织在巴黎召开了一次专题研讨会，与会者包括科学家、哲学家、律师和政府官员，他们呼吁在安全性和功效被确切证明之前，应禁止对人类胚系基因进行“编辑”。“对人类基因组的干预应仅可用于预防、诊断或治疗目的，不能用于对后代进行改造。”联合国教科文组织国际生物伦理委员会在一份公告中称。他们指出，后者会“把全体人类固有的和平等的尊严置于危险境地，并且将改写优生学”。

　　在华盛顿会议结束后发表的声明中，与会者称，“进行任何生殖细胞的基因编辑的临床应用都是不负责任的”，并且“任何临床实验都必须在适当的监管下进行”。

　　英国《新科学家》杂志在12月5日发表的一篇社论中指出，华盛顿峰会的参与者中有当年推动过阿西洛玛会议的人士，希望他们能够“吸取历史的经验”。

　　1975年，超过150名来自世界各地的著名生物学家在美国加州阿西洛玛（Asilomar）召开了一项会议，围绕DNA重组技术的生物安全性展开了激烈的讨论。

　　当时，DNA重组技术刚刚兴起，科学家们成功地将两个不同物种的DNA连接起来，通过这一手段，可以把哺乳动物中合成胰岛素的基因转入细菌内，利用细菌快速繁殖的特点，生产提取丰富的胰岛素。

　　然而，该技术也可以将其他物种的基因引入哺乳动物甚至是人类细胞中，这一可能性引发了科学界对于人工改造人类遗传基因的担忧。通过阿西洛玛会议，科学家们确立了重组DNA实验研究的指导方针，同时就一些暂缓或严令禁止的实验达成共识。

　　如今，基因工程又走到了一个新的十字路口。

　　简单来说，最新出现的基因编辑技术能够精确地改变人类的DNA。它能够“关闭”某些基因，也能够给人增加特定的基因。这样的技术以往通常是在科幻影视作品中看到。尽管人为修改人类DNA在现实中也早就不是一件新鲜事，但从没有一项技术能够像CRISPR这样精准和高效地完成这件事。

　　首先，借用一种无害的病毒，向导RNA、剪切蛋白和替代DNA被输入细胞中。然后，向导RNA和剪切蛋白贴上目标DNA。剪切蛋白将DNA的双链剪断，细胞自身的DNA修复机制马上会启动对DNA的修复，此时作为替代的DNA片段被接入原有的DNA。这样，就完成了对基因的修改。

　　在实验室中，使用传统的DNA同源重组技术构建基因敲除小鼠不仅操作繁琐、花费昂贵，而且需要耗时1-2年的时间。而使用CRISPR技术成本较低，而且只需要掌握最基本的分子生物学手段便可以在短短3个月内实现基因敲除。

　　自2012年CRISPR技术被阐明后，科学家已经陆续运用该技术为人类健康与疾病治疗领域带来了诸多福音。实验证明，使用CRISPR技术敲除感染动物细胞的乙肝病毒内的致病基因，可以有效地杀死乙肝病毒，为彻底治疗乙肝带来了希望。细菌的抗药性是人类对抗细菌过程中难以突破的屏障，然而使用CRISPR技术敲除赋予细菌抗药性的基因，能够大大提高抗生素的效用。

　　因为CRISPR技术的快捷、廉价、适用性广等特点，已经有至少四家基因编辑公司着手于将CRISPR技术转化为临床治疗手段的研究，盖茨基金会和谷歌风投基金这样的重量级投资者也参与其中。

　　随着CRISPR技术的发展，越来越多的人意识到它不仅可以用于改造病毒、细菌和普通哺乳动物的细胞，人类基因组也可以成为CRISPR的编辑对象。《麻省理工技术评论》于2015年3月5日发表评论文章《定制完美婴儿》，其中就提到科学家已经发明出可以编辑人类胚胎基因的技术，我们是否该阻止它的发展的问题。

　　人们担心这项技术可能带来“定制化的婴儿”。婴儿在出生前，其基因就可以根据需要进行修改。一些来自父母的遗传疾病可以被消除，但另一方面，父母缺乏的基因也是可以被添加上去的。理论上说，这可能改变孩子的发色、肤色，乃至智商。而且，这些基因上的修改有可能会被遗传下去，最终的效应难以预料。

　　就在《麻省理工技术评论》的那篇文章在社会上引起巨大反响、各方还在因为伦理问题展开激烈辩论的时候，2015年4月18日，来自中山大学的生物学副教授黄军就的研究组在《蛋白与细胞》（Protein & Cell）上发表论文，首次报道了使用CRISPR技术对人类胚胎细胞进行基因编辑的研究，修复了乙型地中海贫血病的缺陷基因，探索了今后治疗某些遗传疾病的可能。至此，基因编辑人类胚胎的猜想变成了事实。

　　CRISPR技术的发现者之一、法国微生物学家埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）认为“发现来得有点突然”。同时，她也没有预料到这项技术会引起巨大的争议。

　　基因编辑技术甚至会导致新的物种诞生。 （南方周末资料图/图）

　　并未完全关上的大门

　　“我希望人们不会去追求利用这项技术改变人类特征的想法。”卡彭蒂耶最近表示，“当把它用于治疗和预防目的——而不是用于制造可以在人种中遗传的特征，那么讨论的重点就会是，对于某些特定的疾病，也许进行胚系基因编辑是可以考虑的方式。”

　　“届时，问题就变成，社会是否想迈出这一步。”她继续说，“从哲学上和社会学上来说，我对此存有诸多疑虑。”

　　参与华盛顿会议的学者们也达成共识，他们在公告中称“胚系基因编辑带来诸多重大问题”。

　　他们的担心，包括了基因编辑过程中的“脱靶效应”，即实际发生改变的基因并非实验者的预设。学者们同时指出，“考虑到与其他遗传变异和与环境的相互作用，想要预测基因改变在人群中所带来的有害效应是困难的。”

　　“一旦将（基因）修改引入了人类种群，遗传的变化将很难被消除，也不会仅仅局限在任何单一的社群或国家。”参与会议的12人在声明中说，“对特定人群进行永久性的基因‘强化’，可能会导致社会不公，也有可能被强制使用。”

　　在会议过程中，科学家们的确探讨了基因编辑技术用于“强化人类”的可能性。它是否能够把人类改造得对疾病更具抵御能力，或者提高人类大脑的认知能力？与会科学家认为，人们对基因在人类认知水平和其他许多特征中的作用仍然知之甚少，此时不能乱来。

　　“结论是，怀有敬畏之心。在我们对人类基因池做出任何永久性改变之前，我们应该极为谨慎地行事。”麻省理工博德研究所的艾瑞克·兰德（Eric Lander）这样说。

　　在这次最新的大讨论中，科学家并没有呼吁完全禁止基础研究层面上对人类胚胎和生殖细胞进行基因编辑。他们认为基础研究的意义是极其深远的。

　　在声明中，参与者指出，强化基因编辑技术的基础和临床前期研究不应被暂停或终止，而是应在适当的法律和道德监管监督下继续开展。一些正在对疾病进行研究的科学家，担心对基因编辑技术的过多限制会影响到治愈疾病的进展。

　　简单来说，科学家对于人类遗传基因研究有两个禁区，一是不允许非治疗性的生育筛选，二是不允许对基因做可遗传的人工编辑。华盛顿会议的参与者特别提到，经过基因编辑的早期人类胚胎或生殖细胞不得用于怀孕目的。不过，声明也指出：“随着科学知识的进步和社会认识的发展，对生殖细胞编辑的临床使用应定期重新评估。”

　　“我们不想把这扇大门一下子关上。”美国加州大学伯克利分校的生物化学家詹妮弗·端娜（Jennifer Doudna）说。