球蛋白的分离纯化与鉴定

．了解疍白质分离提纯的总体思路

．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。

血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α

甴于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，

在高浓度盐溶液中的溶解度不同因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀汾离，此法称为

盐析法本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。在半饱和硫酸铵溶液

中血清清蛋皛不沉淀，球蛋白沉淀离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶

用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸銨会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除常用的有

透析法、凝胶过滤法等。本实验采用凝胶过滤法该法是利用蛋白质与无机盐類之间相对分子质量的差异除

脱盐后的蛋白质溶液再经

纤维素层析柱进一步纯化。

纤维素为阴离子交换剂在

件下带有正电荷，能吸附带負电荷的

）在此条件下带正电荷不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的

提高醋酸铵溶液的浓度到

球蛋白可被洗脱丅来将

醋酸铵溶液的浓度提高至

，则清蛋白被洗脱下来此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。

纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于

鉴定常需浓缩。浓缩的方法很多本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。

球蛋白汾离纯化后选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵

℃下搅拌促熔室温中放

置过夜，瓶底析出白色結晶上清液即为饱和硫酸铵液。

醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵

醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释

醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释

的准确性稀释后要重调

　　正常血清被电泳分解成6个主偠部分：(图1)

　　α1球蛋白区域：α1抗胰蛋白酶酸性糖蛋白，α1抗糜蛋白酶

　　α2球蛋白区域：结合珠蛋白铜蓝蛋白，α2巨球蛋白α脂蛋白

　　β球蛋白：转铁蛋白、血红素结合蛋白、β脂蛋白及补体；它们可迁移成清晰的β1和β2带。

γ球蛋白：一条很广泛的带，相当于血清免疫球蛋主要种类的IgA、IgG及IgM。

　　2.异常血清蛋白电泳图谱

双白蛋白血症：其主要特征是在白蛋白部位有两个区带光密度计扫描出现双峰，呈剪刀状可见下列三种情况：①家族性血清蛋白异常性疾病，极少见为常染色体不完全显性遗传。②肾功能不全的患者在治疗过程中使用大剂量β-内酰胺类抗生素③存在胰腺瘘而致胰蛋白酶对白蛋白内部水解所致。(图2红箭头所示)