当前位置： >>
WB整体解决方案
Western Blot整体解决方案蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ,WB） 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到 固相载体（杂交膜）上，最后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待测标本中 的表达情况。目前Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一。本方案书按照Western Blot 操作的基 本过程来解析一些主要的要点和注意事项、常见问题分析，旨在能为各位老师在进行实验时提供点滴参考。Western Blot 基本操作流程图及相关产品 细胞/组织蛋白提取蛋白定量、煮沸处理 蛋白定量产品 蛋白抽提试剂、蛋白酶抑制剂上样、电泳流 程 蛋白 MAKER相 关 产 品转膜PVDF 膜/NC 膜封闭洗膜 考马斯亮蓝染色、 丽春红染色试剂一抗孵育洗膜二抗孵育洗膜封闭液、 一抗、 二抗、 抗体稀释液、 蛋白印迹处理仪器底物孵育HRP 预混底物、DAB 显色液、TMB 底物溶液、其它显色试剂盒曝光或显色膜再生液备注：右列方框内所列代表广州英韦创津生物科技有限公司有相关产品提供，见后面介绍。WB 第 1 步：组织或细胞蛋白提取、样本处理1. 蛋白提取蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关 重要的！我们结合本司畅销产品，为您提供各种蛋白标本制备试剂盒。相关产品信息供货商 货号 产品名称 CytoBuster Protein Extra YeastBuster Protein Extra 大肠杆菌蛋白抽提：预混了核酸酶，专一去除核酸，常 Merck 70584-3 BugBuster Protein Extra 温孵育，替代超声波、压榨等机械处理方法，方便健康 亚组分蛋白抽提：据溶解度不同抽提获得四个蛋白组 Merck KIT Subcellular Proteome Extra 分：细胞质组分、细胞膜组分、细胞核组分和细胞骨架 蛋白组分，不需超高速离心 核蛋白抽提试剂盒：半小时简单操作，制备产物适合多 Merck 71183-3 NucBusterTM Protein Extra 种下游应用 线粒体/胞浆蛋白分离：可从多种哺乳动物细胞中分离 abcam ab65320 Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit 出线粒体部分和胞浆部分，蛋白保持原有的活性，操作 简便，无毒，无需超速离心。也可用于分离完整的线粒 体架构。 Transmembrane Merck 71772-3 Protein Extra Kit Merck 71296-3 Phosphosafe Extra 跨膜蛋白抽提：用于温和、高效地从哺乳动物细胞或组 织中抽提膜蛋白（单次至七次跨膜），无需超速离心， 20 rxn 制备产物有天然结构和活性 磷酸化蛋白抽提：保护蛋白的磷酸化状态，特别推荐用 于激酶研究，操作简便，高效富集，得率高 25 ml 100test 100 rxn 20 rxn 100 ml 产品说明 哺乳动物细胞裂解液：代超声波法，温和地从昆虫或哺 Merck 71009-3 乳动物细胞中抽提可溶性蛋白， 并保持抽提蛋白的活性 用于后续的检测及纯化 酵母蛋白抽提：温和地从酵母中高效抽提可溶性蛋白 100 ml 50 ml 规格Merck71186-32. 蛋白酶抑制剂选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！相关产品信息供货商 货号 产品名称 AEBSF,HCL 产品说明 单一抑制剂：水溶性，无毒的 PMSF 替代物，丝氨酸蛋白酶 Merck
mg 的不可逆抑制剂。抑制糜蛋白酶、激肽释放酶、纤维蛋白溶 酶、胰蛋白酶等 Protease Cocktail Phosphatase Inhibitor Cocktail Inhibitor 抑制剂混合物：蛋白酶广谱抑制剂（含EDTA），可用于细菌 细胞抽提物、哺乳动物细胞核组织抽提物，与金属螯合层析 兼容 磷酸酶抑制剂：抑制 Ser/Thr 磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 1SET 1ML 100mg 规格MerckMLMerckSETMerckSETPhosphatase Inhibitor Cocktail磷酸酶广谱抑制剂：抑制酸性、碱性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷 酸酶 1SET3. 蛋白定量蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前 常用的主要有BCA法、Bradford 法和Lorry 法三种。相关产品信息供货商 货号 产品名称 产品说明 测定范围为 20-2000μg/ml，数分钟内得到检测结果，在某些 Merck 71285-3 BCA Protein Assay Kit 化合物及去污剂存在的情况下仍可获得准确的检测结果， 但 螯合剂、强酸、强碱、还原剂有可能干扰实验结果。 Merck 488250 Non-Interfering Assay Kit Brandford 蛋 白 定 量 试 剂 盒 Protein 采用 BCA 法， 操作简单， 克服蛋白溶液中可能含有的去污剂、 螯合剂、还原剂等得影响 含有配置好的考马斯亮蓝溶液和 BSA 溶液，测定范围为 25-1000μg/ml（595nm 读数）；兼容性广，蛋白测定不受绝 大部分样品中化学物质的影响；即开即用，方便操作。 测定范围为 20-2000μg/ml；兼容性好，对去垢剂耐受能力大 TIANGEN PA115-01 BCA 蛋白定量试剂盒 为提高，在 Tween20 低于 4%的范围内，即可获得准确定量 结果；便捷快速，1h 内完成蛋白定量检测，工作液配置后 24h 内使用无影响 500 test 500 test 500test 500test 规格TIANGENPA1024. 样品处理1)变性、还原标本 ? 在标本中加入含有SDS的上样缓冲液，然后在95-100℃煮沸5-15分钟，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变 为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有时也可以在70°C加热5-10分钟，尤其适用 于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率）。 ? ? ? 标准的上样缓冲液是2X Laemmli buffer，有时为了减少标本的稀释比例，也可以制备4X 和6X 的上样缓冲液。 如果使用2X 缓冲液，则缓冲液和标本的比例为1:1。 在加热/煮沸前后，均需要充分漩涡混匀标本。 上样量： 一般为20-40ug， 根据样本中待测蛋白的表达水平， 做出合适的优化。 上样量过多会出现非特异性染色； 过少则会导致检测不到出现假阴性的结果。 Laemmli 2X buffer 的配方：4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl调整 pH 值到 6.8 2)天然和非还原标本 ? 有些抗体识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态（一般在抗体的说明书中都会有特殊说明）。对于 这类抗体检测的标本，只需要在缓冲液和凝胶中去除SDS即可，并且不能对蛋白进行加热变性。 ? 有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类标本，就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂DTT 和β-巯 基乙醇去除。 先根据待测蛋白状态确定电泳条件：备注：除非说明书有特殊说明，一般 WB 均为变性和还原电泳条件。WB 第 2 步：电泳和转膜、封闭1.电泳1） 制备凝胶 SDS-PAGE 凝胶可以购买商业化的也可以自行配制，不论选择哪种，确定合适的凝胶浓度是十分关键的。凝胶的浓 度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。需要根据待测蛋白分子量大小确定分离 胶的浓度，参阅下表：2） 选择合适的对照 成功进行Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找 到Western Blot 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！ 一般需要设置的对照如下：? 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 ? 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 ? 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 ? 内参对照：检测标本的质量和二抗系统 ? 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果Abcam 抗体说明书中一般有推荐的阳性对照类型，同时Abcam 还提供大量的细胞和组织裂解物，可用作WB 的阳性对照。 3） 蛋白质分子量Marker 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，通常选择蛋白质分子量Marker（市售有不同大小的 预染和非预染蛋白Marker）。蛋白质分子量Marker 的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确 与否的保证！预染Marker 更方便直接观察电泳和转膜效果。畅销预染Marker信息供货商 Abcam Abcam TIANGEN TIANGEN TIANGEN 货号 ab41746 ab48854 MP203 MP204 MP205 产品名称 protein Molecular Weight Marker protein Molecular Weight Marker 预染蛋白质 Maker II （蓝色） 预染蛋白质 Maker III（蓝色） 双色预染蛋白质 Maker 产品说明 14.6-112kDa 8.5-70kDa 19-117 kDa 18-94 kDa 18-100 kDa 规格 500ul 500ul 20 test 20 test 20 test4） 上样与电泳 ? ? 将处理后的标本直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。 电泳时间： 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准 的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。2.转膜1） 杂交膜的选取 杂交膜是WB 进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个WB的实验是非常重要和关键的。可以根据不 同的检测目的和待测蛋白的特性， 选择合适的膜类型。 常用的转移膜类型有： PVDF 膜、硝酸纤维素膜 （NC 膜） 和尼龙膜，其中PVDF 和NC 膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：参数 灵敏度和分辨率 背景 蛋白结合能力存在时与蛋白结合） 机械强度 溶剂抗性 使用前是否需要浸润 适用染色方法 适用检测方法 PVDF 膜 高 低 100-200ug/cm2（适用于SDS 强 强 100%甲醇润湿 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快 速免疫检测 普通蛋白WB、糖蛋白白质测序、氨基酸分析、重复 检测 高 NC 膜 高 低 80-100ug/cm2 干的膜易脆 差 缓冲液润湿 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 显色法、化学发光、荧光、放射性 普通蛋白WB、 氨基酸分析、 重复检测。 0.1um 膜适用于7kDa 以下蛋白 较低适用范围 价格备注：PVDF膜需要小心预处理：将膜剪成合适的大小，在甲醇中浸润1-2分钟后，在预冷的转膜buffer中孵育5分钟，凝胶也需要在预冷 的转膜buffer中平衡3-5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。相关产品信息供货商 货号 产品说明 Immobilon-P 26.5 x 3.75m Roll PVDF 0.45um Immobilon-P Membrane, PVDF, 0.2 μm Immobilon-NC Membrane, mixed cellulose esters, 0.45 ?m Immobilon-NC Membrane, Triton-free, mixed cellulose esters, 0.45 ?mSQ规格 26.5 cm x 3.75 m 26.5 cm x 3.75 m 30 cm x 30 cm 33 cm x 3 mMerck （Millipore） IPVH00010 Merck （Millipore） ISEQ00010 Merck （Millipore） HAHY304F0 Merck （Millipore） HATF000102）转膜条件 ? ? 转膜时间一般为30-60 分钟。也可以在15-20mA 转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定， 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进 行转膜。 3）转膜效率检测 ? ? 在转膜后使用丽春红（可逆染色）对杂交膜染色，同时使用考马斯亮蓝对转膜后的凝胶进行染色，检测凝 胶上的蛋白是否已经完全充分的转移到杂交膜上。（膜有很清晰的蛋白条带，而凝胶上无蛋白存在）。 使用预染蛋白Marker，检测Marker 的转移情况，当和目的蛋白大小相当的Marker 完全转移后即可停止， 但是有时需要相对延长一些时间，因为Marker 相对目的蛋白会比较容易转移。相关产品信息供货商 货号 产品名称 考马斯亮蓝蛋白快速染色 TIANGEN PA101-01 液 丽春红 S (Ponceau S) 产品说明 染色快，脱色快，全过程仅需10min；无毒，不含甲醇、乙 酸；低背景，高灵敏度，BSA灵敏度可低至30ng；易操作， 易保存，不需特殊设备，脱色后凝胶可在纯水中保存数月。 室温（20℃）溶解。 10 100ml 规格Merck4）大分子量或者小分子量蛋白的转膜注意事项 转膜缓冲液中SDS和甲醇的比例、蛋白分子量大小和凝胶的浓度都能影响到转膜的效率。对于一些大分子量或 者小分子量的蛋白，可通过以下方法来增加转膜效率。 ? 对于大分子量蛋白(&100 kD) ? ? ? ? ? 大分子量蛋白转移很慢，就像他们在凝胶中分离的比较慢一样。确保大分子量蛋白的凝胶浓度低于8%。 大分子量蛋白容易沉淀在凝胶中，难于转移，可在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS来缓解该现象。另外甲醇 可能会将SDS从蛋白中去除，所以将转膜缓冲液中的甲醇浓度降到10%或以下，可以使转膜更加容易进行。 只有在使用硝酸纤维素膜（NC膜）时，甲醇才是必须的。如果使用PVDF膜，可将甲醇从转膜缓冲液中去除 （只在前期膜处理的时候使用甲醇）。 选择在4℃转膜过夜，来替代常规的半干转膜。对于小分子量蛋白(&100 kD) ? ? SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中 去除。 保持甲醇的浓度在20%。另外，如果你的目的蛋白大于500kDa，请参考以下文献来确定有效的转膜： Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfateCpolyacrylamide, gel electrophoresis.Analytical Biochemistry 247, 185C192 (1997).5）关于转膜的其它注意事项： ? ? ? ? 避免直接使用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大或过小都会影响转膜效率 鸡来源的抗体与PVDF 和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用 硝酸纤维素膜.3.封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋 白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换 膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 1）常用的封闭试剂：有1-3%的BSA 或者5%的脱脂奶粉，缓冲液一般选择PBST 或者TBST。根据结果情况调整封闭 试剂的浓度和类型。比如有时BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下 才能得到清晰的背景。 2）封闭条件：室温或者37℃ 1-2hr，特殊情况也可4℃过夜。 3） 洗膜条件： 封闭完成后要进行洗膜， 以去除膜上未结合的封闭试剂。 洗涤液使用TBST 或者PBST， 其中的Tween 有 助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如5-6 次，每次3 分钟）比长时间少次数的洗膜更 有效。相关产品信息供货商 货号 产品名称 产品说明 专门设计的即用型封闭试剂，适用于 IHC，WB，ELISA。 Abcam ab64226 Protein Block 组份：BSA, Casein, PBS, Sodium Azide, pH 7.4。WB 用法： 室温孵育 1hr 或者 4 过夜 Merck GM BSA Blot-QuickBlocker Reagent 快速封闭试剂 SignalBoost Merck 407207 Immunoreaction Enhancer Kit 本产品无需稀释，开瓶即用，室温下轻微振荡 30-60min， TIANGEN PA106-01 Western Blot 膜封闭液 即可完成膜的封闭 100ml Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals， 纯度 ≥98% 高效封闭试剂，15-20min 内可完成封闭操作，使背景更 清晰，可降低反应背景 抗体稀释液，显著提高 WB 及 Elisa 信噪比，节约宝贵抗 体 50UG 250g 125ml 规格MerckWB57175 g4）在选择封闭剂时，要注意一些特殊情况? 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。 ? 如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白会受到影响，因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。 ? 检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭试剂WB 第 3 步：抗体孵育和检测1.一抗孵育1）一抗的选择： 一抗选择成功与否，是整个WB 实验成功的关键： 1） 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 2）选择适用于WB 实验方法的一抗（说明书有验证） 3） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体Abcam 作为全球前3位的抗体供应商，提供超过8万种高质量的抗体，抗体种类齐全，能适用于大部 份检测，其中大部分抗体是适用于WB 检测的。? ? ? ? 客户评价Abcam抗体为最有效抗体(Bioinformatics LLC) 世界上最大的优质抗体目录 超过 1400份上季刊登的研究报告应用了Abcam抗体 我们已有80892种抗体和试剂Abcam 最具优势的产品包括以下： ? ? ? 线粒体研究（Mitoscience）：Abcam新收购的全球领先的线粒体研究工具供应商，超过200种产品? ? ? ? ? ? ? ?神经生物学（Neuroscience）：超过20,000种产品 干细胞（Stem Cell）：超过14,000种产品 染色质和核信号通路（Chromatin and Nuclear Signaling）：超过20,000 种产品 肿瘤生物学（Cancer）：超过24,000 种产品 信号转导（Signal Transduction）：超过41,000种产品 细胞生物学（Cell Biology）：超过18,000种产品 免疫学（Immunology）：超过19,000 种产品 心血管研究（Cardiovascular）：超过16,000种产品 发育生物学（Developmental Biology）：超过3,400种产品 微生物学（Microbiology）：超过4,500种产品相关产品信息供 货 商 Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam 货号 ab4074 ab7291 ab21058 ab6046 ab20272 ab6276 ab8227 产品名称 Rabbit polyclonal to alpha Tubulin-Loading Control Mouse monoclonal [DM1A] to alpha Tubulin-Loading Control Rabbit polyclonal to beta Tubulin-Loading Control(HRP) Rabbit polyclonal to beta Tubulin-Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam 8226] to beta Actin-Loading Control (HRP) Mouse monoclonal [AC-15] to beta Actin Rabbit polyclonal to beta Actin-Loading Control 反应种属Hu,Ms,Rt,Ch,Co,CHO Pi,Hu,Ms,Rt,Xe,Co,Ch,Do,Gp Hu,Ms Hu,Ms,Rat,Chk,Ch Hm Hu,Ms,Rb,Rt,Ch,ChHt,Co,Do,Fruitfly,Pi,AGMk,Sc Hu,Ms,Rt,Carp,Ca,Ch,Co,Do,Dm,Gp,Ht,Mk,Pi,Rb,Sh Hu,Ms,Rb,Xe,Co,CAbcamab14744Mouse monoclonal [20E8] to COX IV-Mitochondrial Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam 9484] to GAPDH-Loading Control (HRP) Mouse monoclonal [1TBP18] to TBP-Nuclear Loading Control and ChIP GradeHu,Ms,Rt,Co,HtAbcamab9482Hu,Ms,Rt,Rb,Xe,Co,Ch,Do,Pi,ChHtAbcamab818Hu,Ms,Rt更多产品和技术资料，请登陆 www.abcam.cn 或致电广州英韦创津生物科技有限公司查询！另外，我司现正式代理的Merck Millipore也可以为您提供大量优质抗体，Merck Millipore具有优势的产品包括以下: ? ? ? ? ? 神经生物学 表观遗传学-组蛋白检测 干细胞 信号通路研究 4G10 酪氨酸磷酸化检测金标准更多产品和技术资料，请登录www.millipore.com或致电广州英韦创津生物科技有限公司查询！2）一抗的保存和使用： ①根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20℃保存，绝对避免反复冻融。 ②抗体的工作液最好现配现用，在4℃保存最好不要超过2 周。 ③由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个 浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。 ④根据说明书推荐浓度使用TBST 稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度 （1:100-1:3000）。 ⑤ 孵育条件：推荐4°C 孵育过夜（一般大于18 个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别。也可以室温 1-2hr。 ⑥抗体稀释液：有些实验室惯于使用含有封闭试剂（BSA 或者脱脂奶粉）的TBST/PBST 来作为抗体稀释液，而有些 实验室则惯于直接使用TBST/PBST 作为抗体稀释液。具体需要根据实验结果来做出适当的调整。 ⑦洗涤液使用TBST 或者PBST，其中的Tween 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6 次，每次3 分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 注意：如果背景不是很高，很多抗体在含有低浓度BSA 或脱脂奶粉（0.25-0.5%）的稀释液中会有很好的信号。 3）内参的使用： 在WB 试验中，最重要和最不可或缺的对照就是内参照（Loading Control，Internal Control）。内参照的使用有两个 方面的作用： 1） 检测整个WB 实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效 的情况下），那么这个体系就是存在问题的了 2）半定量的标准：内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为 检测靶蛋白表达量的标准。WB 常用内参及其技术参数2.二抗孵育1）二抗选择： 根据一抗来源种属以及抗体Ig 亚型选择合适的二抗。比如，如果一抗是小鼠IgG 来源的抗体，二抗需选择抗小 鼠IgG 的；如果一抗是小鼠IgM 来源的抗体，则二抗要选择抗小鼠IgM 的。 2）孵育条件： 根据说明书推荐浓度使用TBST 稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释 度（1:00）。 孵育条件一般为室温1-2 小时。抗体稀释液：有些实验室惯于使用含有封闭试剂（BSA 或者脱脂奶粉）的 TBST/PBST 来作为抗体稀释液，而有些实验室则惯于直接使用TBST/PBST 作为抗体稀释液。具体需要根据实验 结果来做出适当的调整。 洗涤液使用TBST 或者PBST， 其中的Tween 有助于去除非特异性的结合， 减少背景。 同时短时间多次的洗膜 （如 5-6 次，每次3 分钟）较长时间少次数的洗膜更有效。常用畅销二抗产品：供货商 Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam 货号 ab64226 ab6741 ab6742 ab6885 ab6720 ab6747 产品名称 Goat polyclonal to Chicken IgY H&L (HRP) 1 Rabbit polyclonal to Goat IgG H&L (HRP) Rabbit polyclonal to Goat IgG H&L (AP) Donkey polyclonal to Goat IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Rabbit IgG H&L (biotin) Rabbit polyclonal to Sheep IgG H&L (HRP) GOAT ANTI-MOUSE IGG PEROXIDASE CONJUGATE（HRP） ELISA(1:,00 ； 备注Merck（Millipore） DC02L-200UGImmunoblotting(1:,000, 比色法 1:10,000-1:200,000, 化学Merck（Millipore） DC03L-200UGGOAT ANTI-RABBIT IGG PEROXIDASE CONJ.（HRP）发光)； IHC (1:500-1:5000)；常规 备货更多产品和技术资料，请登陆 www.abcam. www.millipore.com 或致电广州英韦创津生物科技有限公司查询！3. SNAP i.d. ? Western Bloting 加速器综述--优化转印方案, 比传统免疫检测方法节约 80%的时间相关产品信息供货商 Merck （Millipore） WBAVDBASE SNAPi.d.DoubleWell Blot Holder 货号 产品名称 产品说明 WB 蛋白检测系统：封闭，洗涤和抗体孵育只需 30 分 钟 SNAP.I.D 双孔转印支架 1 EA 规格Merck （Millipore）WBAVDBH02SNAP i.d. Double Well Blot Holder 30PK30 个/包4.底物孵育和检测1）化学发光法（ECL）：灵敏度高，已经成为一种使用趋势，推荐使用。需要暗室或者检测仪器。更推荐使用灵敏 度更高的ECL+。 2）显色法：操作简单、无需暗示等曝光设备。相关产品信息供货商 Merck （Millipore） Merck （Millipore） WBLUR0100 货号 WBKLS0100 产品名称 ImmobilonTM Western HRP 底物(传统型) LuminataTM Western 产品说明 高灵敏度,低背景,灵敏度可以到达 0.5-0.25pg,覆盖面积 1000cm2 无需预混，一瓶搞定; 信号稳定可长达 3 小时；多灵敏度 多选择；重复性好；室温保存稳定； 灵敏对达到:1pg；覆盖面积 1000cm2 TIANGEN PA112-01 Pro-light HRP 化学发光检 测试剂盒 基于 Luminol 的化学发光底物试剂， 由辣根过氧化物酶 （HRP） 1 kit 催化发生化学反应，发出荧光。灵敏度高，高信噪比，发光 迅速，持续时间可达 1h，稳定性好。 TIANGEN PA110 增强型 HRP-DAB 底物显 色试剂盒 由试剂 A：DAB 底物储存液，试剂 B：稳定的过氧化物，试 剂 C：增色溶液组成；显色过程需要避光，显色后可拍照或 扫描；使用 A、B、C 试剂显色后的免疫组织可用 Nuclear fast red 复染。 TIANGEN PA111 BCIP/NBT 底物显色试剂 盒 基于碱性磷酸酶催化底物 BCIP/NBT 在目的蛋白位置转变为 蓝褐色化合物，从而根据颜色反应来鉴定碱性磷酸酶的量， 而确定目的蛋白的量。含有检测碱性磷酸酶的所有试剂。使 用方便， 只需取适量的 BCIP/NBT 加入缓冲液中， 将 PVDF/NC 膜浸入该生色底物混合物中，室温摇动即可；根据实验要求 在蛋白带的颜色深度达到要求时（约 10-20min），终止显色 反应获得理想结果；转印膜显色后可长期保存，不易褪色。 TIANGEN PA108-01 沉淀型单组分 TMB 底物 溶液 Merck Merck 64 BCIP/NBT AP Detection Reagent Kit 与辣根过氧化物酶（HRP）反应形成沉淀蓝褐色产物，本产 品为一步即用型溶液，无需混合，方便用户使用。 即开即用型AP显色底物 包括标准化的BCIP溶液，NBT溶液和200XAP缓冲液，获得灵 敏的AP显色结果 Merck Merck 818 DAB Substrate Buffer Rapid Step ECL Reagent 10xDAB底物缓冲液 一步法ECL发光试剂，A/B液合二为一，无需预混；独特喷壶 式设计，轻轻一喷，2min即可完成孵育，可检测2000cm2膜 50ml 100ml 100ml 1 Kit 100ml 1 kit 1 kit 100ml 规格 100mlHRP 底物 （预混型）5.杂交膜反复利用很多实验室因为标本比较珍贵，或者为了节省膜的用量，惯于将杂交膜反复利用，即检测一个蛋白后用洗脱液处理 后再检测另一个目的蛋白。相关产品信息供货商 TIANGEN 货号 PA114 产品名称 Western Blot 蛋白印迹膜 再生液 产品说明 效力强，作用温和，通常可以重复利用膜 5 次或者更多；不 含 β-巯基乙醇，没有异味；无需稀释，开瓶即用，简便快速， 室温下振荡 10-30min 即可完成。 规格 100mlWB 常见问题及分析问题 可能原因 膜没有完全均匀湿透 靶蛋白分子量小于10,000 靶蛋白等电点等于或接近转移 缓冲液pH 值 转膜不充分 甲醇浓度过高 转移时间不够 膜没有完全均匀湿透 洗膜不充分 封闭不充分 二抗浓度过高 检测过程中膜干燥 曝光过度 背景高 抗体与封闭蛋白有交叉反应 验证或解决办法 使用 100% methanol 浸透膜 选择小孔径的膜，缩短转移时间 可尝试使用其他缓冲液如CAPS 缓冲液（pH10.5)或使用低pH 值缓冲液如乙酸缓冲 液 过高甲醇浓度导致蛋白质与SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或 变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 使用 100% methanol 浸透膜 增加洗液体积和洗涤次数（如 5*5min） 增加封闭液孵育时间（推荐4°C过夜孵育），或者提高温度（至 37°C）；选择合适 的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） 降低二抗浓度 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 缩短曝光时间 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应 增加一个二抗对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系 统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） 增加抗体浓度，延长孵育时间 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活 性的酶联物 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或 靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可 以验证二级检测系统的有效性 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠二抗的非特异性背景 抗体染色不充分 酶失活 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含 量太低 试剂之间不匹配 没有阳性条带 一抗失效 HRP 抑制剂问题可能原因 抗体染色不充分 酶活性降低 标本中靶蛋白含量太低 洗膜过度验证或解决办法 增加抗体浓度，延长孵育时间 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活 性的酶联物 增加标本上样量 缩短洗涤时间 择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 见上述有 阳性条 带， 但条带比较弱抗体活性降低 选 蛋白转移不充分封闭过度 曝光时间过短 HRP 抑制剂 二抗的非特异性结合 一抗的特异性不够 蛋白降解 抗体浓度过高 不同剪切体存在 细胞传代过多，导致蛋白变异 蛋白上样量过大 二聚体或多聚体存在 翻译后剪切 条 带位置 （大 小）不对 相对电荷（Relative charge） 蛋白修饰 背 景有黑 色斑 点 背 景有不 均匀 的白色斑点 膜 上出现 反像 （ 暗背景 上白 色带） 电泳速度过快 微笑条带 Marker 变黑色 电泳温度过高 抗体和Marker 蛋白反应 HRP 含量过高 抗体与封闭试剂反应 HRP 耦联二抗中有聚集体 转膜过程中有气泡存在 抗体分布不均匀减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 延长曝光时间 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 增加一个二抗对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系 统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都 是不同的 使用原代或传代少的细胞作对照 降低上样量 增加蛋白质变性过程及强度 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的 形式，如pro-caspases 氨基酸的组成(charged vs non-charged) 比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加 使用前过滤封闭试剂 过滤二抗试剂，去除聚集体 仔细检测，避免存在气泡 孵育抗体时使用摇床非特异性条带 （多条带）降低酶联二抗的浓度减少电压等减慢电泳速度 在冷室或者冰浴中进行电泳，改变电泳pH值 在Marker 和sample 之间空出一个孔不上样关于磷酸化蛋白检测的注意事项：? ?保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂，并将标本时刻保持在冰浴中！ 使用5%的BSA 作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉！（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现高背景） 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的！当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照！?附 录蛋白提取相关 bufferBuffer 名称细胞骨架蛋白提取bufferWB 常用缓冲液配方配方 10 mM Tris, pH 7.4; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM NaF; 20 mM Na4P2O7; 2 mM Na3VO4 ; 1% Triton X-100; 10% 0.1% SDS; 0.5% deoxycholate可溶性蛋白提取buffer:20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EGTA (Ca2+ chelator) 50mM Tris HCl pH 8 150 mM NaCl 1% NP-40 0.5% sodium Deoxycholate 0.1% SDS 20 mM Tris HCl pH 8 137 mM NaCl 10% glycerol 1% nonidet P-40 2 mM EDTARIPA 裂解液 (RadioImmuno Precipitation Assay buffer) Nonidet-P40 (NP-40) 裂解液核蛋白提取相关试剂：Buffer A C 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.05% NP40 (或0.05% Igepal 或 Tergitol) pH 7.9 按如下方法准备250 ml储存液buffer A： HEPES: 1M = 238.3 g/L, 则10 mM = 0.59 g/250 ml MgCl2: 1M = 203.3 g/L, 则1.5 mM = 0.076 g/250 ml KCl: 1M = 74.5 g/L, 则10 mM = 0.187 g/250 ml DTT: 1M = 154.2 g/L, 则0.5 mM = 0.019 g/250 ml NP40 = 0.05% Buffer B C 5 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 26% glycerol (v/v), pH 7.9 按如下方法准备250 ml储存液buffer B： HEPES: 1M = 238.3 g/L, 则5 mM = 0.295 g/250 ml MgCl2: 1M = 203.3 g/L, 则1.5 mM = 0.076 g/250 ml EDTA: 1M = 372.2 g/L, 则0.2 mM = 0.0186 g/250 ml DTT: 1M = 154.2 g/L, 则0.5 mM = 0.019 g/250 ml 26% Glycerol (v/v) = 65 ml 4.6 M NaCl - 87.66 g/326 ml注意：10% sodium deoxycholate 储存液(5g加入50 ml水) 必须避光保存。 100 mM EDTA储存液：1.86 g加入40 ml H2O，然后加入NaOH调整pH到7.4。 调整总体积到 50ml。4°C 保存.其他常用 bufferBuffer 名称 TBS 10x 储存液： TBST 1L溶液: 配方 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl加入800ml超纯水混匀，用纯HCl 调整pH到7.6，加水到1L. 100 ml 10xTBS + 900 ml 超纯水+1ml Tween20TBS (Tris Buffered Saline)pH 7.6-7.8 10L: TBS 0.025% Triton X-100: PBS: 1%BSA TBS buffer Medium stripping buffer:60.6 g TRIS HCl; 13.9 g TRIS base 87.66 g NaCl 10 litres 超纯水 (H2O) 1L: 250 μl Triton X-100; 999.75 ml TBS pH7.6-7.8 1.16g Na2HPO4, 0.1g KCl, 0.1g K3PO4, 4gNaCl (500 ml双蒸水) pH 7.4 10 mg BSA; 1ml TBS pH 7.6-7.8 15g glycine, 1g SDS ,10 ml Tween20,调节pH值到2.2， 加超纯水至总体积1 L 洗脱步骤： 1. 加入可覆盖膜的洗脱液，室温孵育5-10分钟，弃液体 2. 再用新鲜的洗脱液孵育5-10分钟，弃液体 3. PBS洗膜2次，每次10m分钟 4. TBST洗膜2次，每次5 分钟 膜处理完毕可重新开始封闭等下一个抗体检测Harsh stripping buffer100 ml:20 ml 10%SDS,12.5 ml 0.5M Tris-HCl pH 6.8 , 67.5 ml 超纯水, 在通风橱中加0.8ml ?-mercaptoethanol 洗脱步骤： 1. 将洗脱液预热到50°C. 2. 将洗脱液放到有紧紧盖子的小塑料盒中，量以能覆盖 膜为宜 3. 加入膜，在50°C 孵育45 分钟，间断摇动 4. 加入 ?-mercaptoethanol based buffers. 5. 用流水冲洗膜1-2 小时 6. 用TBST 洗膜5 分钟去除多余的?-mercaptoethanol 膜处理完毕可重新开始封闭等下一个抗体检测结束语：本资料著作权和解释权归广州英韦创津生物科技有限公司所有，谨以此作献给广大 WB 战 线上各位老师，希望能为您在进行实验时提供点滴参考，感谢您对我司长期以来的支持和信任。广州英韦创津生物科技有限公司总部服务热线：400-678-67866 传真：020-办事处及分公司联系方式 长沙分公司 深圳办事处 福州办事处 厦门办事处 电话 9 3 5
传真 3 5 5 邮箱：邮箱
赞助商链接}