求帮忙分析下菌液PCR检测结果 - 实验交流 - 生物秀
标题: 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
摘要: [求帮忙分析下菌液PCR检测结果] 各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2 5可能有目的条带，基因6中6 2 1-6 2 5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠 关键词:[引物 质粒 特异性 载体 模板 基因 基因组]……
各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。
ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。
回复检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物回复情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了回复请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高回复我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：
1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化菌株的基因组上又结合位点。上面那个图中，有你要的目的条带，但是有些条带不是很清楚，原因可能很多，如模板量、DNA聚合酶用量的差异的等。这个可以不用管，这个实验是有和无的关系，可以选三个有目的带的样品测序，最终结果是以测序为准的，菌体PCR只是初步筛选的过程。
2. 感觉是你引物选用的不对。我们常用的载体上都用通用的测序引物（如如M13F、M13R、T7、Sp6等，若真没有，可以自行设计一条20bp左右的引物），可以和你目的片段的一条引物配对，这个可以以没有外源片段的载体作对照，这样获得的结果可行对比较高。不能直接用扩增你目的片段的方法，没有说服力；
3. 菌体电泳，直接用碱裂解法的溶液I和溶液II裂解菌体后，进行电泳，以没有外源片段的载体作对照，条带相对滞后样品就是应该是连入外源片段的。
4. 可以酶切载体，再以没有连接外源片段载体的酶切产物作对照。这个方法比较麻烦，不推荐。
通过这几种方法筛选到的阳性克隆，直接以菌体送去测序公司测序分析。你所要的阳性克隆，最终还是要通过测序结果的序列分析确定。回复直接以菌液为模板通过PCR扩增目的基因来检测连接情况很简单，建议设计引物，扩增片段小一点，PCR用25微升体系，1微升模板就可以了回复
检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物 可能是特异性不够，但是PCR扩增的时候扩出来的条带是单一的回复
直接以菌液为模板通过PCR扩增目的基因来检测连接情况很简单，建议设计引物，扩增片段小一点，PCR用25微升体系，1微升模板就可以了 我也了解整个操作过程及原理比较简单，但是我做出来的就是这样的结果，而且类似的其他基因也出现这种情况，我体系用的是20微升，模板1微升回复
情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了 提取质粒检测效果要好一些吗？回复
提取质粒检测效果要好一些吗？ 那是必然了，肯定能排除基因组的影响啊！特别是针对特异性不高的引物而言回复
请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高 关于引物，是我自己设计的，可能特异性不高，我是用的普通PCR扩增时用的引物，单克隆我是通过蓝白斑筛选的，实验室的其他人说他们挑出来的一般都是阳性的，质粒PCR效果要好一些吗？回复
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：
1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转 ... 谢谢您的回复及帮助。关于载体我用的是宝生物的PUC19-T载体，整个连接用的是他们的盒。菌液PCR的引物与普通PCR相同，都是我设计的扩增基因的，退火温度及反应体系也与扩增基因的相同。
关于送测序的问题，同课题组的同学说亮度不高的，送出去测序的意义不大，我就没有考虑。
引物是我自己设计的，由于是第一次，可能有点问题，确实是特异性不够高，但是是以回收的片段进行连接的，这个还是单一的，不知道为什么出现这么多杂带回复
那是必然了，肯定能排除基因组的影响啊！特别是针对特异性不高的引物而言 你说的基因组的影响是指？我的引物确实特异性不够高回复
你说的基因组的影响是指？我的引物确实特异性不够高 细菌的遗传物质包括细菌本身的基因组（或者不严格的叫染色体）还有就是游离的质粒，你的叙述中显然是要鉴定质粒？那么就需要提基因组了，你的引物的特异性不高，这一步是必须的回复可以提一下质粒，跑电泳和空白质粒对照回复
细菌的遗传物质包括细菌本身的基因组（或者不严格的叫染色体）还有就是游离的质粒，你的叙述中显然是要鉴定质粒？那么就需要提基因组了，你的引物的特异性不高，这一步是必须的 好的， 谢谢您的回复，我明天做一下这部分回复
可以提一下质粒，跑电泳和空白质粒对照 谢谢您的帮助，准备着手开工了回复
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：
1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化 ... 我是新手 想问一下怎么样裂解菌体成为模板啊？回复
我是新手 想问一下怎么样裂解菌体成为模板啊？... 我建议，在平板上多挑取一些单克隆，用1.0ml LB液体培养基在1.5ml Ep管中培养10-15h（培养时，最好倒置Ep管），然后取1-2ul做模板常规PCR扩增。
对于E.coli，只要在PCR程序的第一变性时间延长5min就可以了裂解菌体。
有问题，可以随时和我联系。谢谢。
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大神帮忙分析下这个阵容怎么打？
如图所示，前期就拿了7个人头，下路被抓嘣～请问是阵容的问题吗，后来就抓不到人了～
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确实阵容上没有对面好。对面抓和团都强过你们。要打赢很难。必须要先秒卡牌。
只有2种可能性能打。1、伤害足够的情况下，你必须出到破败或者有幽梦，开团就只套大给小炮，就只杀小炮。因为你追小炮了还会把莫甘娜或者卡牌拉过去追你。但是你没有破败没有幽梦的情况下，你很难追到小炮。小炮会大你跳往后面再闪现。这段距离有够远的，所以你必须有减速他的技能，或者有加速的技能，你的W还有疾走还不够。2、你家狐狸必须起来，起来到能秒狼人的地步，最起码都能一套把狼人打残，这样狼人无论是大哪个都能你们后方合力秒掉后，你们就占了点优势。然后狐狸有大可以周旋卡牌，莫甘娜已经追你去帮小炮了，这样的团就是55开了。打输或者打赢都只会剩下1个人这样，然后拖着看那边失误，后期一波的事情了。都不满足这两个条件，你们根本没得打。
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