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1、免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳技术n是将电泳与免疫扩散相结合的一种常是将电泳与免疫扩散相结合的一种常用的免疫学实验方法用的免疫学实验方法 。沉淀反应沉淀反应 是是可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在适与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象沉淀现象。分类分类液体内沉淀试验液体内沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定免疫浊度测定凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫扩散免疫电泳免疫电泳单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应沉淀反应火箭免疫电泳n

2、是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。量检测技术。n定量的抗原加入到含有一定量的相应抗体定量的抗原加入到含有一定量的相应抗体的琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，引起的琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，引起抗原抗体的迁移和相互反应，当抗原与抗抗原抗体的迁移和相互反应，当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与待捡样中的抗原浓度呈正相关。度与待捡样中的抗原浓度呈正相关。 应用n当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释

3、度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量便可测定待测抗体的含量( (即反向火箭免疫即反向火箭免疫电泳电泳) )。 对流免疫电泳n将双向免疫扩散与电泳相结合的一种将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。技术。 n此法操作简便，仅需此法操作简便，仅需分钟，灵分钟，灵敏度比双向扩散高敏度比双向扩散高倍；

4、但缺点倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。是特异性不如双向琼脂扩散高。 实验原理n实质上是定向加速的双向免疫扩散技术。实质上是定向加速的双向免疫扩散技术。n在在pH8.6pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于向正极泳动；而抗体大部分属于IgIg，由于，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比例向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。处形成乳白色沉淀线。n电渗是指在电场中液体对于

5、一个固定固体电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab ；D：扩散率近似，浓度：扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab ；F：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab材料和试

6、剂材料和试剂 1 1、AFPAFP诊断血清：诊断血清：2 2、肝癌病人血清：（阳性对照）、肝癌病人血清：（阳性对照）3 3、待检血清：人血清、待检血清：人血清 4 4、阴性对照血清：正常人血清、阴性对照血清：正常人血清 5 5、pH8.6pH8.6、离子强度、离子强度0.05M0.05M巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液6 6、离子琼脂：用巴比妥缓冲液配制。、离子琼脂：用巴比妥缓冲液配制。7 7、电泳仪、电泳仪 8 8、其他：打孔器、移液器，枪头、其他：打孔器、移液器，枪头操作步骤n琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备n打孔、加样打孔、加样n电泳电泳n结果观察结果观察n影响结果的因素影响结果的因素 制板

7、、加样、打孔制板、加样、打孔n用吸管吸取用吸管吸取4ml4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片加热溶化的琼脂铺在载玻片上上, ,待凝。待凝。n打孔打孔: :用打孔器在琼脂板上打孔用打孔器在琼脂板上打孔( (孔距孔距4mm),4mm),如图。如图。n加样加样: :将待测抗原样品约将待测抗原样品约10ul10ul加在阴极侧孔加在阴极侧孔内内, ,抗血清加在阳极侧抗血清加在阳极侧, ,加样时应加满小孔加样时应加满小孔但不能溢出但不能溢出AbAgAbAb：甲胎蛋白诊断血清：甲胎蛋白诊断血清AgAg：1 1、肝癌病人血清（阳性对照）、肝癌病人血清（阳性对照） 2 2、正常人血清（、正常人血清（阴性对照阴性对照）

3、待测血清、待测血清123电泳n将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用四层纱布与别用四层纱布与0.05mol/L0.05mol/L、PH8.6PH8.6的缓冲的缓冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度计液相连，接通电源。电流以玻片的宽度计算，为算，为4mA/cm4mA/cm；电压以玻片的长度计算，；电压以玻片的长度计算，为为6V/cm6V/cm；通电；通电30-60min30-60min后，切断电源，观后，切断电源，观察结果察结果结果和讨论结果和讨论n将玻片对着光，先观察将玻片对

9、着光，先观察AFPAFP阳性血清孔与抗阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示如有沉淀线，则表示AFPAFP试验阳性，否则试验阳性，否则AFPAFP试验为阴性。如沉淀线不清晰，可把琼试验为阴性。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中脂板放在湿盒中3737数小时或置电泳槽过数小时或置电泳槽过夜再观察。夜再观察。 注意事项注意事项1. 1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。2. 2. 抗原、抗体的电极方向不能放反。抗原、抗

10、体的电极方向不能放反。3. 3. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。时间越长。4.4.抗原抗体浓度的比例：当抗原抗体比例不适合时，抗原抗体浓度的比例：当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。行检查。 甲胎蛋白检测意义：甲胎蛋白检测意义：n甲胎蛋白，简称甲胎蛋白，简称AFPAFP，是由胎儿肝细胞合

11、成、，是由胎儿肝细胞合成、在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白。在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白。一般在妊娠后开始上升，至胎龄一般在妊娠后开始上升，至胎龄周周时达到最高峰，然后逐渐下降，至胎儿娩时达到最高峰，然后逐渐下降，至胎儿娩出后出后1-51-5周完全消失。周完全消失。n此外，原发性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬此外，原发性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬化也可升高。原发性肝癌患者，血清中化也可升高。原发性肝癌患者，血清中AFPAFP阳性率常明显升高，超过阳性率常明显升高，超过400400微克微克/ /升（放升（放射免疫定量法），甚至达射免疫定量法），甚至达微克微克/ /升以上升以上或呈进行性升高。或呈进行性升高。AFPAFP的检测不仅有助于原的检测不仅有助

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1、琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Agarose Gel Electrophoresis概概 述述 凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰 胺等物质作支持体的电泳。胺等物质作支持体的电泳。 特点：特点： 1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔 中泳动。中泳动。 2. 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状 高聚物。 琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin） Acid sulfateCarboxylic acid groups在电场作用下能产生较强的电渗现象琼脂糖半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕

2、形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。凝胶。 D-D-半乳糖半乳糖3 3，6-6-脱水脱水- -L-L-半乳糖半乳糖琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点（一）优点（一）优点 1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合 物、核酸、病毒物、核酸、病毒 等大分子物质等大分子物质。 4.4.透明度较好透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.5.不吸收紫外光不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定测定 6.6.有热可逆性有热可逆性（二）缺点（二）缺点 1.1.机械强度差机械强度差，易破碎，浓度不能太低。，易破碎，浓度不能太低。 2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。 3.3.琼脂糖支持层上的琼脂糖支持层上的区带易于扩散区带易于扩散

3、，电泳后，电泳后 必须立即固定染色。必须立即固定染色。 4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小分子筛作用小，区带少。，区带少。 应应 用用1. 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、 鉴定及纯化鉴定及纯化 2. 2. 临床生化检验中常用于临床生化检验中常用于LDHLDH、CKCK等同工酶等同工酶 的分离与检测的分离与检测 3. 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提 供生化指标供生化指标琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白原理血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后， 以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比 妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成 、大小、形状分离成不同区带。 ( (一一) )血清脂蛋白血清脂蛋白(

4、胆固醇 （FCFC）胆固醇酯胆固醇酯 （CECE） 少量糖少量糖（二）分类（二）分类 1. 1. 按电泳法分按电泳法分乳糜微粒（乳糜微粒（chylomicronchylomicron,CM,CM） - -脂蛋白脂蛋白 （ - -位）位）前前 - -脂蛋白（脂蛋白（ 2 2- -位）位） - -脂蛋白脂蛋白 （ 1 1- -位）位） 2. 2. 按超速离心法分按超速离心法分乳糜微粒乳糜微粒( (chylomicronchylomicron, ,CM)CM) ( pIpI ，各种脂蛋白均带负电，电各种脂蛋白均带负电，电 泳时由负极到正极；泳时由负极到正极；VLDLVLDL为圆形，受阻力为圆形，受阻力 小，小，LDLLDL形态不规则，受阻力大，所以形态不规则，受阻力大，所以VLDLVLDL 跑在前。跑在前。加样槽加样槽 前前 CM LDL VLDL HDLCM LDL VLDL HDL+ +临床应用：高脂蛋白血症的分型CM 前 正常 型 a型 b型 型 型 型操作玻璃片预染色的标本预染色的标本正常参考值（百分比） -脂蛋白 30-40% 前-脂蛋白 15% -脂蛋白 55%l l注意事项：注意事项：血清样品要新鲜；血清样品要新鲜；为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应 吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣 ，否则应再离心后吸预染血清，否则应再离心后吸预染血清。 名词解释名词解释 1.1.迁移率迁移率 2.2.电渗电渗 3.3.电泳电泳 问答题问答题 1.1.影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。复习思考题复习思考题参参 考考 书书 目目临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验 第三版第三版人民卫生出版社人民卫生出版社 周新周新 主编主编电泳科学出版社电泳科学出版社 何忠效何忠效 张树政张树政 主编主编蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术 科学出版社科学出版社 郭尧君郭尧君蛋白质技术手册蛋白质技术手册 科学出版社科学出版社 汪家政汪家政 范敏范敏 主编主编

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