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自噬抑制剂氯喹对体外活化肝星状细胞胶原代谢的影响
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自噬抑制药物氯喹在诱导肝癌细胞死亡中的机制研究
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关注微信公众号上传用户：ntrrgjnmpg文档下载 ：『』&&『』『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）肝纤维化(Hepatic fibrosis， HF)是各类分歧致病身分惹起慢性肝病进而成长为肝硬化的共有病理转变和必经门路，是肝脏对各类慢性毁伤发生的一种修复反响。其重要病理特点是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix， ECM)在肝组织内的过度分解和异常堆积。肝纤维化是可逆的，而肝硬化则难以逆转。是以，阻拦乃至逆转肝纤维化是医治各类慢性肝病、预防其向肝硬化成长的症结地点。关于肝纤维化的防治，迄今尚乏真正有用医治手腕，深刻研讨肝纤维化的病发机制进而摸索有用防治办法，关于医治各类慢性肝病，预防其向肝纤维化、肝硬化成长有侧重要意义。肝星状细胞(hepatic stellate cells， HSCs)是肝纤维化产生进程中发生ECM的重要细胞，HSCs活化是肝纤维化构成的细胞学基本，在肝纤维化成长进程中饰演主要脚色。运动状况下，HSCs胞浆内富含脂滴，已有研讨注解脂滴的存在能克制HSCs的活化，而HSCs活化的最具特点性表示是胞浆内脂滴的丧失，转化为肌成纤维细胞，并重要经由过程两种感化机制增进肝纤维化过程：以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM成份生成过量，降解缺乏；分解并释放一些主要的增进纤维化产生、慢性炎症和血管生成的细胞因子。最近，Friedman等研讨发明，在HSCs活化进程中，胞浆内脂滴的丧失与自噬(autophagy)相干，自噬可经由过程降解脂滴为HSCs活化供给能量。相反，克制自噬可削减HSCs活化并下降其纤维生成才能，重要表示为α一腻滑肌肌动卵白(α一smooth muscle actin， α一SMA)、Ⅰ型胶原等表达降低。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区零落的双层膜包裹部门胞质和细胞内需降解的细胞器、卵白质等构成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融会构成自噬溶酶体(autolysosome)，进一步降解其所包裹的过剩的卵白质和亚细胞成份，以完成细胞自己代谢须要和某些细胞器的更新，保持本身的稳固。自噬的全部进程重要分为3个阶段：自噬体的初步构成；自噬体膜的延长；自噬体与溶酶体融会并降解。氯喹(Chloroquine， CQ)可经由过程降低溶酶体内PH值，阻拦自噬体与溶酶体的联合而克制自噬。今朝国际外对自噬在肝纤维化中的研讨重要着重于其对肝星状细胞活化的影响，而自噬对活化后的HSCs的生物学感化尚缺少研讨报导。本试验以此为动身点，研讨运用分歧浓度的自噬克制剂CQ干涉活化的HSC一T6细胞后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达及基质金属卵白酶（matrixmetalloproteinase， MMPs）、基质金属卵白酶组织克制因子（tissue inhibitionof matrix metalloproteinase， TIMPs）的表达变更，旨在完美自噬对HSCs胶原代谢的影响。目标：研讨分歧浓度的自噬克制剂CQ对活化HSC一T6的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响和该进程中MMP一2、TIMP一2、MMP一13和TIMP一1的表达变更。办法：运用TGF一β1安慰年夜鼠肝星状细胞系HSC一T6，使其处于完整活化状况，赐与分歧浓度的CQ干涉24h。试验分组以下：①Control组，仅以含10％胎牛血清的DMEM细胞造就液造就细胞，在TGF一β1安慰步调参加等体积TGF一β1的溶剂枸橼酸钠溶液；②TGF一β1组，以含10％胎牛血清的DMEM细胞造就液造就细胞，待70%融会后参加终浓度为20ng/ml的TGF一β1；③TGF一β1+CQ15μmol/L组，在赐与TGF一β1安慰的同时参加浓度为15μmol/L的CQ干涉；④TGF一β1+CQ30μmol/L组，在赐与TGF一β1安慰的同时参加浓度为30μmol/L的CQ干涉；⑤TGF一β1+CQ60μmol/L组，在赐与TGF一β1安慰的同时参加浓度为60μmol/L的CQ干涉。采取MTT法检测细胞活气；Western blot技巧检测自噬标识卵白LC3一Ⅱ/LC3一Ⅰ和P62卵白的表达情形；免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的定位表达量；Western blot技巧检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP一2、TIMP一2、MMP一13和TIMP一1卵白的表达；Real一time Q一PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP一2、TIMP一2、MMP一13和TIMP一1基因程度的表达变更。成果：①用含10％胎牛血清的DMEM细胞造就液造就细胞，待70%融会后参加TGF一β1，浓度分离为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml，干涉24h后，采取MTT法检测细胞活气并绘制曲线，肇端跟着TGF一β1浓度的降低细胞活气显著加强，在浓度到达20ng/ml后，持续降低浓度细胞活气增长不显著。是以，选择20ng/ml作为本试验的干涉浓度。②运用Western blot技巧检测LC3一Ⅱ/LC3一Ⅰ和P62卵白在上述5组细胞中的表达，其成果显示：LC3一Ⅱ/LC3一Ⅰ的绝对表达量顺次为0。63±0。08、0。61±0。12、1±0。1、1。5±0。3、2。4±0。17，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。01），TGF一β1+CQ组之间也有明显性差别（P《0。01）；P62卵白的绝对表达量顺次为4。4±0。4、4。1±0。33、5。9±0。25、6。2±0。31、6。1±0。43，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。01），而TGF一β1+CQ组之间无明显性差别（P》0。05）。③MTT法检测细胞活气显示：以Control组的细胞活气界说为100%，其他4组分离为115%、89%、48%、27%，TGF一β1组较Control组明显降低，TGF一β1+CQ组较Control组和TGF一β1组均明显降低（P《0。01），TGF一β1+CQ组中随CQ剂量增长，细胞活气降低具有明显性差别（P《0。01）。④Western blot技巧检测α一SMA表达，其绝对表达量顺次为0。84±0。12、1。23±0。21、1。18±0。16、1。2±0。23、1。31±0。33，TGF一β1组和TGF一β1+CQ组均明显高于Control组（P《0。05），而TGF一β1组和TGF一β1+CQ各组之间无明显性差别（P》0。05）。⑤免疫细胞化学染色显示：TGF一β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较Control组明显增长，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组也有显著增长。⑥运用Western blot技巧检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在上述5组细胞中的表达，其成果显示：Ⅰ型胶原的绝对表达量顺次为0。81±0。13、1。12±0。11、1。43±0。17、1。6±0。14、1。95±0。2，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。01），TGF一β1+CQ30μmol/L组明显高于TGF一β1+CQ15μmol/L组（P《0。01），TGF一β1+CQ60μmol/L组明显高于TGF一β1+CQ30μmol/L组（P《0。05）； Ⅲ型胶原的绝对表达量顺次为0。84±0。15、1。28±0。2、1。84±0。13、3。1±0。23、3。9±0。32，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。01），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。01）。⑦运用Real一time Q一PCR办法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，其成果显示：以Control组的mRNA表达量为1，Ⅰ型胶原其他4组的绝对表达量顺次为1。8±0。06、2。1±0。11、2。5±0。08、2。8±0。13，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）；Ⅲ型胶原的绝对表达量顺次为2。1±0。13、2。7±0。07、3±0。17、3。7±0。09，TGF一β1+CQ组均明显高于TGF一β1组（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）。⑧运用Western blot技巧检测MMP一2和TIMP一2卵白的表达，其成果显示：MMP一2卵白各组的表达量顺次为1。01±0。11、0。67±0。08、0。69±0。06、0。71±0。1、0。74±0。09，TGF一β1组和TGF一β1+CQ组较Control组显著降低（P《0。05），但TGF一β1组和TGF一β1+CQ各组之间没有明显性差别；TIMP一2的绝对表达量顺次为0。87±0。08、1。19±0。13、1。31±0。11、1。58±0。17、1。82±0。16，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显增长（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）。⑨运用Real一time Q一PCR办法检测MMP一2和TIMP一2的mRNA表达，其成果显示：以Control组的mRNA表达量为1，MMP一2其他4组的绝对表达量顺次为2。61±0。11、2。8±0。1、3。2±0。14、3。8±0。17， TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显增长（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）；TIMP一2其他4组的绝对表达量顺次为1。5±0。03、2。8±0。06、3。6±0。06、4。2±0。02，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显增长（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。01）。⑩运用Western blot技巧检测MMP一13和TIMP一1卵白的表达，其成果显示：MMP一13卵白各组的表达量顺次为：1。64±0。03、1。27±0。07、0。84±0。1、0。55±0。07、0。46±0。09，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显降低（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）；TIMP一1卵白各组的表达量顺次为：0。84±0。11、1。02±0。09、1。25±0。04、1。48±0。12、1。6±0。05，TGF一β1+CQ组明显高于TGF一β1组（P《0。01），TGF一β1+CQ各组之间具有明显性差别（P《0。01）。○11运用Real一time Q一PCR办法检测MMP一13和TIMP一1的mRNA表达，其成果显示：以Control组的mRNA表达量为1，MMP一13其他4组的绝对表达量顺次为3。1±0。12、2。2±0。06、1。8±0。03、1。2±0。03，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显降低（P《0。05），TGF一β1+CQ各组之间也有明显性差别（P《0。05）；TIMP一1的绝对表达量顺次为2。7±0。05、3。3±0。1、3。8±0。04、4。8±0。07，TGF一β1+CQ组较TGF一β1组明显增长（P《0。01），TGF一β1+CQ各组之间有明显性差别（P《0。05）。结论：自噬克制剂CQ能明显增长HSCsⅠ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依附性，这能够与其上调TIMP一1及TIMP一2的表达，克制MMP一13的表达有关。Abstract:Liver fibrosis (fibrosis Hepatic, HF) is a kind of disease causing chronic liver disease caused by chronic liver disease and then grow up to a total of pathological changes and the way to go through the road, is a kind of chronic damage to the liver of a repair response. The important pathological characteristic is composed mainly of collagen extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) in the liver tissue over decomposition and abnormal accumulation. Liver fibrosis is reversible, and cirrhosis of the liver is difficult to reverse. Is to prevent and even reverse the liver fibrosis is to heal all kinds of chronic liver disease, prevention of the crux of the problem to the liver cirrhosis. Prevention and treatment of liver fibrosis, so far is not really useful to cure the wrist, a profound study of the disease mechanism of liver fibrosis and explore useful ways to prevent and treat all types of chronic liver disease, prevention of liver fibrosis, cirrhosis of the growth of the important significance. Hepatic stellate cells (hepatic stellate cells (HSCs) is important cell ECM occur in the process of liver fibrosis, activation of HSCs is composed of liver fibrosis cytological basic, in the growth process of liver fibrosis plays the main role. Sports situation, HSCs cytoplasmic lipid droplets, the presence of the lipid droplets can restrain the activation of HSCs, and HSCs activation of the most characteristic is the loss of cytoplasmic lipid droplets, into muscle fibroblasts, and important through the two mechanisms to enhance the process of liver fibrosis: collagen I, collagen type ECM ingredients generated excess, degradation of the lack of a number of major increase in the production of fibrosis, chronic inflammation and angiogenesis cytokines. Recently, Friedman and other research and invention, in the process of HSCs activation, the loss of lipid droplets in the cytoplasm and autophagy (autophagy) coherence, autophagy can be degraded by the process of fat droplets for HSCs activation energy supply. On the contrary, restrained autophagy can cut HSCs activation and decreased the fiber in order to generate a important representation for alpha smooth muscle muscle protein (alpha smooth muscle actin, alpha SMA), type I collagen expression decreased. Autophagy is refers to the autophagosome (autophagosome) from the rough endoplasmic reticulum ribosome free attachment area scattered bilayer package department cytoplasm and cell domestic demand degradation of organelles, protein structure, and forms of autophagy lysosome (autolysosome) and lysosome fusion, further degradation of the wrapped in excess of proteins and subcellular components, to complete their cell metabolism needs and some organelles update and maintain stability. Autophagy and the whole process is divided into three stages: autophagosome co extension of aut autophagosome and lysosome fusion and degradation. Chloroquine, CQ) by reducing the soluble enzyme in the body pH value, block of autophagosomes and lysosomes joint and restrained autophagy. Current international research on autophagy in liver fibrosis is an important focus on its effect on the activation of hepatic stellate cells, and the biological effects of autophagy on the activation of HSCs is still lack of research reports. After the experiment, taking this as the starting point, research using different concentrations of autophagy restraint agent CQ interference activated HSC - T6 cells and type I and III collagen expression and matrix metal albumen enzyme matrix metalloproteinase (MMPs), matrix metal albumen enzyme organization restraint factor (tissue Inhibitionof matrix metalloproteinase TIMPs) expression changes to perfect autophagy on collagen metabolism in hepatic stellate cells (HSCs) effect. Objective: To study the effects of different concentrations of autophagy inhibitor CQ on the expression of HSC I and III collagen in activated T6 and MMP 2, TIMP 2, MMP 13 and TIMP 1 expression changes in the process. Methods: the use of TGF a beta 1 to comfort the rat hepatic stellate cell line HSC a T6, so that it is in a complete state of activation, giving the concentration of CQ interference 24h. The test group: group Control, only with DMEM containing 10% fetal bovine serum cell culture medium produced in TGF cells, a beta 1 pace in a volume of TGF comfort beta 1 solvent sod the TGF beta 1 group, containing 10% fetal bovine serum DMEM cell culture medium produced cell 70%, to be integrated in the final concentration of 20ng/ml TGF beta 1; the TGF beta 1+CQ15 mol/L group, at the same time to give TGF a beta 1 comfort in the concentration of 15 mol/L interference CQ; the TGF beta 1+CQ30 mol/L group, at the same time to give TGF a beta 1 comfort in the concentration of 30 mol/L interference CQ; the TGF beta 1+CQ60 mol/L group, at the same time to give TGF a beta 1 comfort in the concentration of 60 mol/L CQ interference. Take the MTT assay was used to dete Western blot techniques to detect autophagy identified protein LC3 II /LC3 (a) I and p62 localization of immune cells chemical detection of type I and III Western blot technique to detect the type I collagen, type III collagen and MMP - 2 and TIMP 2, MMP 13 and TIMP 1 real time Q PCR detection of type I collagen, type III collagen and MMP - 2 and TIMP 2, MMP 13 and TIMP 1 gene level expression changes. Results: (1) containing 10% fetal bovine serum DMEM cell produced liquid to create cells, fusion of 70% to be in TGF beta 1 and concentration on separation 5ng / ml and 10 ng目录:摘要4-8ABSTRACT8-12前言14-15材料与方法15-25结果25-29附图29-38讨论38-40结论40-41参考文献41-43综述 自噬与肝脏疾病的研究进展43-51&&&&参考文献48-51致谢51-52个人简历52-53分享到：相关文献|自噬 - 搜狗百科
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自噬是一个吞噬自身蛋白或并使其包被进入囊泡，并与融合形成，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从的无附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、 等成分形成（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和 中都能见到，其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明，对肿瘤的研究尤其如此，值得关注。
(1)饥饿应答时的作用,在不同的器官如肝脏或在培养细胞中, 的匮乏会诱导细胞产生,由自体吞噬分解大分子,产生在和过程中所必须的中间代谢物。(2)在细胞正常活动中的作用,如在动物的、老化和分化过程中,自体负责降解正常的蛋白以重新组建细胞。尽管通常人们认为自体 不具有选择性,但是在某些病理和压力条件下,通过自体能选择性地隔离某些细胞器,如线粒体、等。(3)在某些组织中的特定功能,如黑人的中,能神经元中的神经黑色素的合成就需要把细胞质中的多巴胺醌用AV包被隔离起来。
在此过程中，自噬体的形成是关键，其直径一般为 300 ~ 900 nm，平均 500 nm，囊泡内常见的 有胞质成分和某些如、内吞体、 等。与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有 8 min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。由于自体吞噬较少受到关注,而且很难在体外实验条件下实现,因此到目前为止,对自体吞噬的机制还不是很了解。研究主要集中在酵母及其它重要的,而对植物和 细胞中的自体吞噬过程的了解则更少。尽管对自体吞噬具体过程的了解还需要大大加强,但是人们已经勾勒出自体吞噬过程的大致轮廓:中的线粒体等细胞器首先被称为“ ”的囊泡所包被,这种“”主要来自于和;囊泡最终形成双层,即自(autophagosome),也称之为初始(initial autophagic vacuoles , AVi);自吞噬体与融合形成中间自体吞噬泡(intermediate autophagic vacuoles, AVi/d);最终自体吞噬泡的外膜与融合形成降解自体吞噬泡(degrading autophagic vacuoles, AVd),由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。在整个自体吞噬过程中,细胞质和细胞器都受到破坏,最明显的是线粒体和内质网受损。虽然自体吞噬并不直接破坏细胞膜和细胞核,但是有证据表明,在最初断裂或消化后,细胞膜和细胞核会最终变成溶酶体以消化和分解自身。
根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为以下几种。①大自噬：由内质网来源的膜包绕待降解物形成，然后与溶酶体融合并降解其内容物；②小自噬：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解；③介导的自噬（CMA）：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。
自噬体（autophagy）（autolysosome）当自噬体与溶酶体融合后，形成自噬溶酶体。是一种自体 , 作用底物是内源性的,即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。这种溶酶体广泛存在于正常的细胞内，在细胞内起“”作用，作为细胞内细胞器和其它结构自然减员和更新的正常途径。在组织细胞受到各种理化因素伤害时，自噬性溶酶体大量增加，因此对细胞的损伤起一种保护作用。自噬性溶酶体的作用底物是内源性的，即来自细胞内的衰老和崩解的细胞器或局部细胞质等。它们由单层膜包围，内部常含有尚未分解的内质网、 和或脂类、糖原等。正常细胞中的自噬性溶酶体在消化、分解、自然更替一些细胞内的结构上起着重要作用。当细胞受到、射线照射和 机械损伤时，其数量明显地增多。在病变的细胞中也常可见到自噬性溶酶体。溶酶体的作用还包括对细胞内物质的消化，溶酶体能消化分解经摄入细胞内的各种物质和细胞内衰亡或损伤的各种细胞器等。吞噬性溶酶体内的各种大分子在的作用下，可被分解为简单物质。例如，能将为二肽或游离氨基酸；把核酸分解为核苷和磷酸；使分解为寡糖类或单糖；将分解为甘油和脂肪酸等。这些被分解而生成的可溶性小分子物质，能透过溶酶体体膜进入，重新参与细胞的物质代谢，一些未被完全消化的物质残留下来，形成残余小体。在骨生长和 过程中，溶酶体对骨质的更新起着重要作用。的溶酶体酶能释放到细胞外，分解和消除陈旧的骨基质，这是骨质更新的一个重要步骤。溶酶体酶释放的具体过程可能是：细胞内的活性发生改变后，随着cAMP的增加，蛋白质激酶被活化而引起及其周围的蛋白质的，其结果微管发生聚集，致使溶酶体向细胞膜方向移动，并与细胞膜相互融合，然后溶酶体内的水解酶被排出细胞外，以分解和消除陈旧的骨质。
正常培养的活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：（一）自噬诱导剂1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（ ）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase， 肌醇单）3）Earle&s：制造饥饿4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂5）Rapamycin：mTOR抑制剂 (最常用)6）Xestospongin B/C：IP3R（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2）Bafilomycin A1：3）Hydroxychloroquine（）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义（Knockdown）、突变株筛选、外源等。（三）自噬检测方法：细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：1）Western Blot检测LC3的切割利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。2）在下采用GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系等来示踪自噬形成：GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出 GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。另一种方法是利用mRFP-GFP-LC3 。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：由于的发展，现在已经诞生了 mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把 自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制， 自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。3）下观察自噬体的形成：自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或，有包绕成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的状结构，内含成分，如、、等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜， 成分已降解。}