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质粒小抽常见的几个小问题
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关于丁香园质粒提取中出现的怪问题（问题已解决）(质粒提取,摇菌,抗生素,质粒) - DNA技术 - 生物秀
标题: 质粒提取中出现的怪问题（问题已解决）(质粒提取,摇菌,抗生素,质粒)
摘要: [质粒提取中出现的怪问题（问题已解决）(质粒提取,摇菌,抗生素,质粒)] 俺做实验快两个月了，郁闷之极！到现在我已经提了一个多月的质粒了，还是在提质粒。碰到的问题很怪：用原始质粒转化细菌后接种至含选择抗生素(antibiotic)的琼脂培养板进行培养，然后挑取单个菌落接种至含选择抗生素(antibiotic)的LB培养基进行摇菌，然后取约3ml进行质粒抽提，可以提出高浓度的质粒。但是问题出在：当取部分菌液进行过夜摇菌时却提不出质粒或者质粒浓度很低。开始以为是抗生素(an 关键词:[摇菌 抗生素 质粒提取 质粒 温度 摇床 培养基]……
俺做实验快两个月了，郁闷之极！到现在我已经提了一个多月的质粒了，还是在提质粒。碰到的问题很怪：用原始质粒转化细菌后接种至含选择抗生素(antibiotic)的琼脂培养板进行培养，然后挑取单个菌落接种至含选择抗生素(antibiotic)的LB培养基进行摇菌，然后取约3ml进行质粒抽提，可以提出高浓度的质粒。但是问题出在：当取部分菌液进行过夜摇菌时却提不出质粒或者质粒浓度很低。开始以为是抗生素(antibiotic)失效，换了新的抗生素(antibiotic)还是一样；又以为是培养基的成分有问题，换了另一实验室的试剂，结果还是一样；又考虑是细菌摇床的问题，换了另一实验室的摇床，结果还是一样，简直是见鬼了。后面又换了几种试剂盒进行提取，结果也没有明显的改观。后面发现摇床的控温不准确（实际温度比显示温度高），用温度计调节好温度再摇菌，结果还是一样，简直快把人逼疯了！现在考虑摇菌时间是否偏长了一点（约14至15小时），拟于下周一再次摇菌，时间控制在10到12小时左右，再摇不出我真的要疯了。请教有无碰到类似情况的朋友，敬请指教！是否还有其他情况，恳请各位朋友不吝赐教！不胜感激！谢谢！
回复建议你用质粒转另外一种大肠杆菌(Escherichia coli)，再提试试。注意转化的步骤，抗生素(antibiotic)琼脂平板是否新制备。回复你始终没有说你提质粒的方法。根据我的经验，只要是菌液达到一定浓度，质粒的量是完全可以保证的。怀疑你提的有问题，问题不是出在摇菌上。回复我也遇到了同样的问题我将质粒转化到金葡里面（金葡要加lysostaphin才能裂解），小抽量很少，于是改为大抽，每次大抽得到的质粒量也很少，完全和E. coli情形不同，而这种质粒是高拷贝的，不知道为什么，都好几个月了 ，好郁闷呀恳请大家有经验的帮帮我，指点迷经回复我觉得有两方面你可以注意下：1 片断产物有毒，细菌都死掉了。 这是我以前遇到过的情况，过夜摇菌后，第二天可见，细菌聚集成颗粒状，提得质粒浓度很低，后来发现是细菌都死掉了，质粒降解了，所以量很低，可能目的基因所表达的蛋白对细菌有毒，后来我换了一下菌株，使用Xl－blue，提质粒就好了。2 有无杂菌污染，Amp培养基摇菌时，由于细菌会把Amp抗生素(antibiotic)降解掉，造成抗生浓度降低，后果就是无抗性细菌疯狂生长，原因就是在抗性菌和非抗性菌都能生长的条件下，非抗性菌具有生长优势，另外菌体里含质粒拷贝数低的细菌较高的细菌具有生长优势。所以大提质粒时，要从新鲜平板上挑取单克隆细菌去摇菌，避免杂菌干扰质粒抽提，过夜培养的时间不要过长。建议你：1 从新鲜平板上挑取菌落来摇菌，按标准步骤来做：新鲜平板上挑取单克隆，震摇培养8小时，然后1/500－1/1000稀释，过夜摇菌12－16小时。2 换菌株，如Xl－blue等。3 如果以前没有大提过质粒的话，还是仔细看下说明书。回复先谢谢楼上各位了！首先，试剂盒应该是没问题的。因为挑取菌落摇菌后同样的试剂盒可以提出来。取少量菌液再摇就提不出或质粒浓度很低了。还是说一下用过的试剂盒：QIANGEN Plasmid
Maxi Kits （大量提取）TIANGEN质粒小提试剂盒（小量提取，换过新试剂盒）Promega公司的小提试剂盒（小量提取）我个人觉得问题出在是摇菌上或细菌菌株上。再摇不出俺也准备换菌株试试了。问题怪就怪在挑取菌落摇菌可以提出高浓度的质粒。现在我强烈怀疑摇菌时间过长营养不够细菌都死掉了，或者像sunyongjun 朋友所说的，片断产物有毒，细菌都死掉了。下一步准备接种少量菌液短时间（10－12小时）摇菌提提看，再摇不出我真的要疯了（老板逼得紧啊！）。求各位朋友再帮忙想想还有没有其他可能的问题！！！先谢谢了！！！回复这个问题我以前也遇过，经实验证明是菌株弱化了。解决方法：你将提取的质粒重新转化一次。然后挑取单克隆进行提取质粒，你就能够恢复提取的能力了。回复谢谢marklin朋友！不知转化是否用原菌株还是换菌株好些？marklin朋友觉得呢？！昨天摇了两个质粒，菌液50ul加LB培养基5ml摇菌10小时，离心三次收集细菌进行质粒小量提取。结果：一个提出了高浓度；另一个还是老样子，5ul跑胶几乎看不到。打算今天再摇一次，还不行可能真的要换菌株了。各位朋友再帮忙想想，看看可不可以不用换菌株。谢谢！回复很有可能是大摇时，许多菌死掉了，我建议你摇菌时间稍短一些，然后将菌液放置于4度过夜，再提，或许会好些，好运！我就是这么做的，呵呵回复很有可能是大摇时，许多菌死掉了，我建议你摇菌时间稍短一些，然后将菌液放置于4度过夜，再提，或许会好些，好运！我就是这么做的，呵呵昨天重新摇了一次，7ml培养基加了60ul菌液，摇菌10小时后收菌，进行质粒提取，和以前的结果差不多。还是一个摇出来了，一个很浅（但还是看得到）。月亮欣朋友觉得摇菌时间10小时还需要进一步缩短吗？另外4度过夜的目的是什么？是想提高质粒的丰度吗？会不会由此增加细菌死掉的数量？我曾经试过在摇菌8小时的时候加入氯霉素（终浓度170ug/ml）以提高质粒的丰度，结果和未加氯霉素的比较菌量和提取质粒的量差别都不明显。回复还是菌的问题，换个菌株就ok了，试试吧：）回复不好意思,我是新手,我想问一下,既然挑取单个菌落了,为什么还要取部分菌液?谢谢了回复不好意思,我是新手,我想问一下,既然挑取单个菌落了,为什么还要取部分菌液?谢谢了挑取单个菌落加入5－10ml 培养基中摇菌8小时，然后再以此菌液为原液，取部分摇菌进行质粒提取。回复谢谢医坛小媛,我还没有开始做实验,对步骤还没有完全了解--谢谢回复大提了一次，浓度低。下一步打算换菌株了。重新挑菌落摇菌，可以提出质粒，浓度高。再摇一次所提质粒浓度就明显低了好多，再问问看有没有朋友碰到这种情况。回复你摇菌时用的是大试管和锥形瓶吗？有没有留点缝隙？回复做感受态之前测过OD600没有啊？回复你摇菌时用的是大试管和锥形瓶吗？有没有留点缝隙？小提时摇菌是用的50ml离心管，大提用的是1000ml三角烧瓶（就是锥形瓶）。每次都留了缝隙的。感受态不是俺自己做的，不知测OD600没有？！请问如果没测会出现这种情况吗？回复忘了给大家个回信了。我换了JM109菌株，用已经提出的质粒（因为原质粒浓度太低，所以没用原质粒）做转化，一代和二代都已经提出质粒了，浓度不错。再次谢谢大家的帮忙！
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