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人ACAT2基因表达的可变性剪接和组织特异性研究及猴ACAT1+cDNA5UTR的克隆分析
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人ACAT2基因表达的可变性剪接和组织特异性研究及猴A
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植物次生代谢产物是一大类的小分子化合物，在植物体中的基础含量一般都很低。然而在生物和非生物的压力胁迫下，或者在一定的诱导条件下，次生代谢产物的产量通常有一定的提高。近年来，为了提高特定的次生代谢产物的含量，代谢工程被广泛应用。随着次生代谢产物生物合成途径中已克隆基因的增多以及代谢途径的进一步阐明，已经有一些行之有效的方法取得了令人欣喜的进展。
在外界生物或非生物的压力胁迫下，一些植物激素，如脱落酸、水杨酸、乙烯以及茉莉酸酮酯(JAs)等在植物中大量积累，通过相互作用，调控植物的信号传递、胁迫耐受以及次生代谢等过程，形成植物的应激系统。其中，茉莉酸酮酯在植物应激反应和次生代谢调控中起着至关重要的作用。此外，茉莉酸酮酯在植物发育的各个阶段也具有重大的意义。
在植物的茉莉酸生物合成途径中，丙二烯氧化物环化酶(AOC，allene oxide cycalse，EC 5.3.99.6)和丙二烯氧化物合成酶(AOS，allene oxide synthase，EC 4.2.1.9)的催化是最重要的酶促步骤。
为了研究药用植物茉莉酸合成途径基因的功能以及它们在次生代谢工程中的应用价值，选取了莨菪和金银花为研究对象。
莨宕是一种重要的药用植物，会产生一类受甲基茉莉酸诱导的色胺类生物碱。我们从中克隆了JA合成途径的基因AOC和AOS，并把AOC基因转入烟草验证了其对次生代谢产物(尼古丁)合成的促进作用。金银花是一种常用的中草药，含有多种次生代谢产物，其中绿原酸是最重要的活性成分，也是衡量金银花质量的指标化合物，我们从中克隆了AOS基因，并发现其组织表达同绿原酸的组织分布有一定的相似性。
1)莨宕丙二烯氧化物环化酶基因(HnAOC)
丙二烯氧化物环化酶(AOC)的催化作用是JA合成途径中最关键的步骤。采用RACE的方法，从莨菪中克隆了AOC基因(HnAOC，GenBank登录号：AY708383)，该基因与其他物种中的AOC基因具有较高的同源性。其cDNA全长为1044 bp，包括5’和3’非翻译区(UTR)、polyA尾和一个长747 bp的开放阅读框(ORF)。HnAOC基因组内含有两个内含子，分别为94 bp和402 bp。HnAOC基因编码的蛋白质共有248个氨基酸，分子量为27.0 kDa，理论等电点8.74。Southern杂交结果显示HnAOC在莨菪中是一个多拷贝基因；RT-PCR分析结果表明，HnAOC基因可被多种不同的诱导因素所诱导表达，从而可以借此调控AOC基因的表达和JA合成。
2)莨宕丙二烯氧化物合成酶基因(HnAOS)
丙二烯氧化物合成酶(AOS)是JA合成途径中的第一个特异性的酶。采用RACE的方法，从莨菪中克隆了AOS基因(HnAOS，GenBank登录号：EF532599)，其cDNA全长为1652 bp，包括5’和3’非翻译区(UTR)，polyA尾和一个长1485 bp的开放阅读框(ORF)，基因组内不含有内含子。HnAOS基因编码的蛋白质含494个氨基酸，分子量为55.8 kDa，理论等电点8.82，属于细胞色素P450大家族。实时荧光定量PCR分析结果显示，在正常生长的植株中，HnAOS基因在茎中表达水平最高。另外，HnAOS基因受伤、甲基茉莉酸的诱导而上调表达，直接的甲基茉莉酸处理比伤诱导的效果在时间上出现得更早，从而佐证了伤诱导的作用是通过茉莉酸合成途径来实现的。
3)转基因烟草中HnAOC的过量表达提高了其抗逆性及尼古丁含量
丙二烯氧化物环化酶的催化是植物JA合成途径中最关键的步骤，而且烟草中尼古丁的代谢受JA的诱导，为了验证JA生物合成途径的基因工程能否使受其诱导的次生代谢产物的含量增加，因此我们将最莨菪的AOC基因转入烟草，以尼古丁含量为代表来验证HnAOC过量表达对次生代谢产物含量的影响。RT-PCR分析结果显示，在转基因烟草中HnAOC均有表达，而烟草AOC基因的表达也增强了；电导率测定结果显示，转基因烟草的叶片在低温条件下离子泄漏程度低于野生型烟草，表现出对低温伤害的耐受性。实时荧光定量PCR(RT-QPCR)结果表明，转基因烟草中尼古丁合成途径的关键酶基因PMT和QPT的表达水平也大幅度提高，HPLC分析结果显示其尼古丁含量也相应提高了。因而，本研究证明了JA生物合成途径的基因操作可以代替繁琐的外源激素处理来提高目的产物的含量，从而为生产受JA诱导的次生代谢产物提供了一个有效的基因工程策略。
4)金银花丙二烯氧化物合成酶基因(LjAOS)
金银花是一种被广泛应用的重要的中草药材料，具有清热解毒，消炎杀菌的功效。绿原酸是金银花的主要功效成分，也是金银花质量监控的指标性化合物，它的含量在不同的组织和花周期中差异较大，其中在花蕾中的含量最高。对于药农和制药厂家来说，药材的质量监控是非常关键的问题，因此金银花采收部位的绿原酸含量备受关注。JA作为一类调控植物发育和次生代谢的植物激素，可能在其中起着重要的作用。在JA的生物合成途径中，AOS是第一个特异性的酶，属于细胞色素P450大家族。为了研究JA合成途径的遗传操作是否可以对绿原酸的合成进行调控，我们首先从金银花中克隆出来一个全新的AOS基因(LjAOS，GenBank登录号：DQ303120)。其cDNA全长为1942 bp，包括5’和3’非翻译区(UTR)，polyA尾和一个长1584 bp的开放阅读框(ORF)。LjAOS基因编码的蛋白质含527个氨基酸，分子量为59.2 kDa，理论等电点为8.41，其基因组中不含有内含子。多重比对表明LjAOS蛋白与其他的AOS蛋白具有较高的同源性，LjAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交结果显示LjAOS基因在金银花中为多拷贝基因；有趣的是，RT-QPCR结果显示LjAOS基因在各个组织中表达量也是在花蕾中最高，这与绿原酸的分布规律具有一定的相似性，揭示了JA的生物合成可能与花的发育以及绿原酸的合成有关。本研究为提高金银花中绿原酸含量提供了一个可供试验的靶点。
综上所述，莨菪和金银花JA合成途径关键酶基因的研究使我们对JA生物合成途径和其在上述两种药用植物中的调控作用有了一定的了解，对于进一步阐明植物JA合成途径及其作用机制和进化有一定的帮助。同时，对转基因烟草抗逆性能和尼古丁含量的研究将有利于JA合成途径基因在植物次生代谢工程中的应用。
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客服邮箱：.cn如图表示我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的具体培育过程．请据图回答下列问题:(1)上述过程涉及的现代生物工程技术.属于分子水平的是 .其核心步骤是 ．(2)若要获得单个的成纤维细胞进行培养.需用 处理猪胚胎的部分组织．(3)E过程中若要获得大量的卵母细胞需用 激素处理成年母猪．(4)H过程的名称是 .所选择的胚胎一般为 ．(5)经过培养得 题目和参考答案——精英家教网——
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如图表示我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的具体培育过程．请据图回答下列问题：（1）上述过程涉及的现代生物工程技术，属于分子水平的是，其核心步骤是．（2）若要获得单个的成纤维细胞进行培养，需用处理猪胚胎的部分组织．（3）E过程中若要获得大量的卵母细胞需用激素处理成年母猪．（4）H过程的名称是，所选择的胚胎一般为．（5）经过培养得到早期胚胎后可以用技术以获得更多基因型相同的转基因克隆猪胚胎，且在进行H过程之前，需要对代孕母猪进行处理，以给早期胚胎移入受体提供相同的生理环境．
考点：基因工程的应用,胚胎移植
分析：分析图解，可以看出该荧光克隆猪涉及了多项生物工程技术．首先导入目的基因的猪的成纤维细胞，要经过动物细胞培养筛选出转基因体细胞，然后该细胞与成年母猪的卵细胞进行细胞核移植获得重组细胞，重组细胞经过早期胚胎培养到桑葚胚或囊胚期，最后经过胚胎移植技术将早期胚胎移植到代孕母猪子宫内，最后生成荧光克隆猪．该过程中利用基因工程、动物细胞培养、细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术．
解：（1）图中绿色荧光蛋白转基因克隆猪的形成过程运用了基因工程、核移植、动物细胞培养、胚胎移植等现代生物工程技术，其中基因工程技术属于分子水平，其核心步骤是基因表达载体的构建．（2）动物细胞培养前，先要用胰蛋白酶处理组织，使组织中的细胞分散开来．（3）用促性腺激素处理母畜，可使其超数排卵，获得大量的卵母细胞．（4）H是胚胎移植过程，一般选择处于桑椹胚或囊胚期的胚胎进行移植．（5）来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，所以将早期胚胎进行胚胎分割后可以获得更多基因型相同的转基因克隆猪胚胎．进行胚胎移植之前，需要对代孕母猪进行同期发情处理，这样可以给早期胚胎移入受体提供相同的生理环境，提供胚胎移植的成功率．故答案为：（1）基因工程&基因表达载体的构建&（2）胰蛋白酶&（3）促性腺&（4）胚胎移植&桑椹胚或囊胚&（5）胚胎分割&同期发情
点评：本题难度适中，属于考纲中理解层次的要求，考查基因工程、胚胎工程和细胞工程等相关知识，该过程中利用基因工程、动物细胞培养、细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术，要求考生具有一定的识图能力和理解能力．
练习册系列答案
科目：高中生物
关于如图所示DNA分子的说法，正确的是（　　）
A、限制酶作用于①部位，DNA连接酶作用于③部位B、该DNA的特异性表现在碱基种类和的比例上C、把该DNA放在含15N的培养液中复制两代，子代中含15N的DNA占D、若该DNA中A为p个，占全部碱基的（m＞2n），则G的个数为-p
科目：高中生物
某同学通过对四条不同曲线的分析，得到以下几种说法．其中正确的是（　　）①通过甲曲线分析可知所得到的这种细菌产物并非是该细菌生长所必需的物质②乙曲线中处于b点时，血糖浓度最高，此时血液中胰岛素的含量最低③丙曲线中处于c点时叶绿素的分解速度大于合成速度，叶片开始变黄④丁曲线中处于d点时，植物生长素仍能够促进芽的生长．
A、②④B、①④C、①③D、③④
科目：高中生物
如图为某家族甲、乙两种遗传病的系谱图．甲遗传病由一对等位基因（A，a）控制，乙遗传病由另一对等位基因（B，b）控制，这两对等位基因独立遗传．已知Ⅲ-4携带甲遗传病的致病基因，但不携带乙遗传病的致病基因．回答问题：（1）乙遗传病的致病基因位于（填“X”“Y”或“常”）染色体上．．（2）若Ⅲ-3和Ⅲ-4再生一个孩子，则这个孩子为同时患甲、乙两种遗传病男孩的概率是．（3）若A基因中编码第105位精氨酸的GCT突变成ACT，翻译就此终止，由此推断，mRNA上的为终止密码子．
科目：高中生物
如图1表示美国J．CraigVenter研究所创造“人造生命”的过程；图2在生物体内，某些重要化合物的元素组成和功能关系，其中X、Y代表元素，A、B、C是生物大分子．请据图回答：（1）山羊细胞与山羊支原体细胞在结构上的根本区别是．用吡罗红甲基绿对山羊细胞进行染色，呈现红色的部位主要是．（2）图1中子代细胞的遗传物质的基本组成单位．（3）图2中X代表．图中[A]和[C]是组成的主要成分．（4）“人造生命”细胞具有的细胞器是．（5）导致地球上生物多种多样的直接原因是图2中[]（填字母和名称）结构的多样性．
科目：高中生物
以下是科学家采用不同方法培育良种牛的过程，a～h为操作过程，据图回答有关问题：（1）“试管牛”技术的操作流程是（填字母）．（2）图中数字标号代表的结构名称是：①③（3）d操作的名称是，图中用到的激素是，过程h常用的方法是．（4）在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，应注意．（5）将③处的细胞分离进行培养，需在培养皿底部铺设一层细胞，称为饲养层，饲养层的作用是．（6）在哺乳动物早期发育过程中，囊胚的后一个阶段是．（7）将早期胚胎移植入受体母牛体内时，需使受体母牛处于状态．
科目：高中生物
如图表示细胞和生物膜结构模式图，图甲中A?B?C?D?E?F表示某些物质，a、b、c、d表示物质进出膜的运输方式，图乙?图丙中序号表示细胞的某些结构?请据图回答：（[]内填字母或序号，横线上填文字）（1）若图甲中的膜是图乙中的紧贴着结构⑤的膜，则膜上起识别作用的物质是[]?（2）图乙所示细胞进行生命活动所需的能量主要是由[]供给，该结构的主要功能是进行，该生理功能消耗的主要能源物质是?所释放的二氧化碳在充足的光照条件下将扩散到[]处被利用?（3）图乙中[⑤]的主要成分是，与其形成有关的细胞器是[]；在细胞长大过程中会逐渐增大，并对细胞的吸水具有重要作用的是?（4）能观测到图乙中各结构的显微镜是显微镜?从结构上看，引起甲型H1N1流感的微生物与图乙最大的不同在于前者．（5）图丙中在有丝分裂间期数量会增加一倍，在分裂前期移向两极的结构是[]?在细胞有丝分裂过程中，会周期性地重建和消失的是[]和[]?
科目：高中生物
如图是新鲜绿叶的四种光合色素在滤纸上的分离结果，以下说法正确的是（　　）
A、色素分离的原理是由于四种色素在层析液中的溶解度不同B、水稻在收获时节，叶片中色素量的变化是（甲+乙）＞（丙+丁）C、四种色素都能溶解在层析液中，乙色素的溶解度最大D、四种色素中，丙和丁主要吸收红光
科目：高中生物
下表是植物不同器官的呼吸速率（单位鲜重在单位时间耗氧量μL?g-1?h-1）
种子（浸泡15h）
960-1480据表分析下列说法错误的是（　　）
A、同一植物的不同器官或组织，呼吸速率存在着明显差异B、种子内胚的呼吸速率比胚乳高，表明胚的能量代谢较旺盛C、测定大麦种子呼吸速率时，通常用NaHCO3吸收产生的CO2D、不同植物的同类器官呼吸速率不同，是长期自然选择的结果
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请输入姓名
请输入手机号蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建--《江苏科技大学》2015年硕士论文
蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建
【摘要】：蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini,eri-silkworm)是室内饲养的重要经济昆虫,以蓖麻叶为主要饲料,属于鳞翅目大蚕蛾科。包括家蚕、柞蚕、野蚕、桑蟥及小菜蛾在内几种鳞翅目昆虫孵化酶基因cDNA业已克隆报道,本文我们对蓖麻蚕孵化酶基因进行研究。根据已报道鳞翅目昆虫孵化酶的基因保守序列,我们设计合成兼并性引物,以蓖麻蚕转青卵cDNA为模版,克隆获得部分蓖麻蚕孵化酶基因(Philosamia Cynthia ricini hatching enzyme,PcrHE)序列,然后通过RACE-PCR和序列拼接获得蓖麻蚕孵化酶基因全长序列。PcrHE全长cDNA为962bp,其中包含3’UTR、5’UTR和885bp的开放阅读框,共编码294个氨基酸,N端16个氨基酸残基为信号肽序列。序列比对的同源性分析显示PcrHE与ApHEL,BmandHE,BmHE,RmHE,PxHE,BmHEⅡ,CuefHCE,DmHEHS,MLCE,XHE,EHE12,ZHCE1,MHCE23,TuHE,Aatacin和QHE的蛋白功能区序列相似性分别为92.3%,84.2%,83.3%,82.4%,79.5%,76.1%,44.7%,43.6%,33.9%,33.7%,32.3%,32.3%,32.1%,31.7%,31.4%和30.8%,根据进化树分析显示蓖麻蚕与柞蚕的亲缘关系最近。根据同源建模的方法对PcrHE进行了三维结构的预测,显示其与蝲蛄金属蛋白酶的三维结构相似,利用PROCHECK对所建蛋白三维结构进行了评价,模拟得到的PcrHE蛋白三维结构有90.2%位于合理区域内,理论上表明蛋白三维结构是可靠的。通过RT-PCR的方法我们发现,在蓖麻蚕卵胚胎发育期不同阶段中,可以在胚胎发育早期检测到PcrHE转录本,维持在较低水平,孵化时达到最高值,表明PcrHE可能与孵化过程相关。另外,PcrHE转录本可在幼虫的中肠和精巢中检测到,推测PcrHE可能还有食物消化、精子发生等其它生物学功能。我们将PcrHE的成熟酶序列、去信号肽序列、ORF序列对应的基因序列分别克隆到原核表达系统pET28a中进行蛋白原核表达,SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达,并用Western Blot进行验证。最后我们克隆了家蚕孵化酶基因启动子(BmHEⅠp,BmHEⅡp),由其驱动蓖麻蚕孵化酶基因,分别构建了转基因重组质粒pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅠp-PcrHE,pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅡp-PcrHE,并尝试将其用显微注射方法导入到家蚕卵中,以期在个体水平验证蓖麻蚕孵化酶的功能。这些研究结果为阐明蓖麻蚕卵孵化的分子机理提供分子依据,为其它鳞翅目昆虫孵化酶研究提供借鉴,为提高鳞翅目昆虫和转基因家蚕的孵化率提供依据。
【学位授予单位】：江苏科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S885.2
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