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运用DHPLC技术分析非纯合缺失型脊髓性肌萎缩症患儿的SMN基因拷贝数
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运用DHPLC技术分析非纯合缺失型脊髓性肌萎缩症患儿的S
官方公共微信副主任医师
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Sma 遗传咨询
状态：就诊前
使用付费咨询服务
患者h***购买了大夫 1 个追问包（99元）
状态：就诊前
希望提供的帮助：
SMN 1基因的第7，8外显子拷贝数约为0.5的突变携带是什么意思？像这样生出患者的几率多大？
所就诊医院科室：
云南省第一人民医院 遗传诊断中心
检查资料：
&副主任医师
1.SMA是一种常染色体隐性遗传病,带有一个致病基因(SMN基因)的个体称为携带者，无异常表现。患者一般携带有两个致病基因，分别来自父亲和母亲。
2.拷贝数为1是正常人群，拷贝数未0.5即表示SMN基因第7、8外显子缺失了一半，为携带者。故此父亲未检测出异常，母亲为携带者，携带者一般不会发病。
3.此基因检测报告（MLPA技术）主要是检测大片段的缺失，微小片段或者基因点突变不能检测。大片段缺失能占到SMA基因突变的80-90%，现有的技术方法不能把所有的SMA基因突变都检测到。
4.推测患儿致病的原因，一个致病基因（SMN基因第7、8外显子缺失）来自于母亲，另一个致病基因可能来自于父亲（父亲的基因突变类型不是这份检测报告（MLPA技术）能检测出的基因突变类型，即20%的其他突变类型），也有可能是患儿自身发生突变所导致，并非遗传。
5.建议，一、先带患儿行基因检测，看是否能检测出两个致病基因（患儿为何未做检查？），与父母的结果进行比较才能更好推论；二、再次怀孕期间，于18周行胎儿产前诊断，即做羊水穿刺取材行SMA基因诊断。因不能排除父亲为少见突变类型的可能，产前诊断的结果需要确认“无SMN基因第7、8外显子缺失”（即母亲的致病基因未遗传给胎儿）才能提示胎儿患病几率较小。
&副主任医师
你的结果较为复杂，给你解释的你如果看不懂，请于下周一，二下午或者周三早上来门诊找我咨询。
&副主任医师
来之前请自己先查阅资料，了解一下SMN1 2+0基因型及SMA的相关知识
状态：就诊前
孩子做过两次两次基因检测，一次在金域检验所做，一次在贵院做，两次都确诊为sma 患者，于上星期离世，在世六个月！我查阅的资料是都是拷贝数2为正常，拷贝数1是携带，拷贝数0是患者！所以就困惑拷贝数约为0.5的突变携带者！ 按你的意思是我们夫妻属于2+0型么？是否还需要做点突变检测？
状态：就诊前
主任，到门诊看的话你的号没抢到怎么办？急死人了????
&副主任医师
过来告诉我情况后来找我直接加号
&副主任医师
带上患儿所有资料
状态：就诊前
主任你是每个周一 二 下午，和周三早上都出诊么？
&副主任医师
是的，你和老公，带齐资料一起过来加号。
&副主任医师
你把患儿的基因诊断结果也发给我看一下，两次的
状态：就诊前
主任，我下午下班回家给你发，可以吗？我今天下乡了
&副主任医师
状态：就诊前
状态：就诊前
状态：就诊前
主任，那个拷贝数是参照Ratio 值么？常见的正常的应该是2，携带是1，患者0，怎么我们是是0.5呢？
&副主任医师
我们的结果是与正常人比较的，正常的有2个拷贝，2:2=1，所以正常人的结果是1。同理，携带者有1个拷贝，1:2=0.5。外显子纯合缺失无拷贝，0:2=0。你功课做的很足，反而看不懂了。
投诉类型：
投诉说明：（200个汉字以内）
张杰大夫的信息
主要从事孕前优生检查，孕期遗传咨询、胎儿疾病风险评估。染色体疾病及常见遗传病的筛查与产前诊断。新生儿...
副主任医师，2008年毕业于上海交通大学附属瑞金医院，获医学遗传学博士学位，近年来从事医学遗传临床工作及...
产前诊断科可通话专家
副主任医师
潍坊市人民医院
产前诊断科
上海市第一妇婴保健院
产前诊断门诊
副主任医师
广州市妇女儿童医疗中心
产前诊断科
副主任医师
潍坊市人民医院
产前诊断科
娄底市妇幼保健院
产前诊断中心
国际妇幼保健院
产前诊断中心
广东省妇幼保健院
产前诊断中心
好大夫在线电话咨询服务君，已阅读到文档的结尾了呢~~
脊髓性肌萎缩症smn基因检测及表达研究,脊髓性肌萎缩症,脊髓性肌萎缩,小儿脊髓性肌萎缩,肌萎缩性脊髓侧索硬化,基因检测,无创产前基因检测,基因检测费用,无创基因检测,地贫基因检测
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脊髓性肌萎缩症smn基因检测及表达研究
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3秒自动关闭窗口o 临床研究
Sanger测序对运动神经元存活基因1复合杂合突变型脊髓性肌萎缩症的诊断价值
: 418-423. DOI: 10.3760/cma.j.issn.17.06.004
摘要 目的建立并评价Sanger测序技术在诊断运动神经元存活基因1(SMN1)复合杂合突变型脊髓性肌萎缩症(SMA)病例中的意义。方法选取首都儿科研究所2014年1月至2016年6月就诊的52例SMA患儿，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增52例患儿的SMN1和SMN2基因第7外显子，Sanger测序通过识别扩增片段中SMN1和SMN2基因固有差异碱基的峰高，判断SMN1基因纯合或杂合缺失。当SMN1基因杂合缺失时，经PCR-Sanger测序筛查SMN基因所有外显子、外显子与内含子交界区域的变异位点。最后通过多重连接探针扩增(MLPA)方法验证SMN1基因杂合缺失，并利用克隆测序确定突变点来自SMN1基因，完成SMN1基因复合杂合突变的确诊。结果经Sanger测序检测的52例SMA患儿中47例为SMN1基因纯合缺失，5例为SMN1基因杂合缺失。MLPA方法验证了后5例患儿SMN1基因拷贝数均为1，Sanger测序检测出5例患儿均存在SMN基因点突变，并通过克隆Sanger测序验证了5例患儿突变均位于SMN1基因。结论Sanger测序技术适用于SMN1基因复合杂合突变病例的诊断，对提高SMA基因诊断率具有临床意义。
Sanger测序对运动神经元存活基因1复合杂合突变型脊髓性肌萎缩症的诊断价值
[J].&中华医学杂志,2017,97(
): 418-423. DOI: 10.3760/cma.j.issn.17.06.004
基金 &关键词
English Abstract
视频 0 论文 0 大综述 0
以下内容版权归属中华医学会，未经授权不得转载。
脊髓性肌萎缩症(SMA)是儿童期较常见的常染色体隐性遗传病，临床常表现为进行性、对称性的四肢和躯干肌肉无力、萎缩。该病在活产婴儿中的发病率约为1/6 000～1/10 000，中国正常人群中SMA的携带率约为1/42[]。国际最新分型及诊断方法根据发病年龄以及所获得的最大运动功能将SMA由重至轻分为0～4型[,]。运动神经元存活基因1(SMN1)是该病的主要致病基因，90%～95%的SMA患儿存在SMN1基因纯合缺失，5%～10%则存在SMN1基因复合杂合突变，即1个SMN1基因缺失，另1个SMN1基因存在点突变[]。SMN1基因复合杂合突变通过不同机制而引起SMA的典型临床表现，所以，从基因水平诊断SMN1复合杂合突变十分重要。人类基因组存在与SMN1基因高度同源的SMN2基因，两者仅有5个碱基的差异，因此，SMN1基因复合杂合突变病例的基因诊断存在一定困难。Sanger测序技术一方面可以利用2个基因之间的固有差异碱基有效区分SMN1与SMN2基因，进而明确SMN1基因缺失类型；另一方面，能够直观地筛查出差异碱基位点以外的碱基变异。本研究建立了基于Sanger测序技术的SMN1基因复合杂合突变的检测方法，并运用此方法有效地检测出5例SMN1基因复合杂合突变病例，并确定其突变位置以及可能的功能影响。对象与方法一、对象选取首都儿科研究所2014年1月至2016年6月就诊的SMA患儿52例，男28例，女24例，就诊年龄为2 d～13.5岁(中位年龄1.2岁)，所有患儿均符合SMA国际最新分型诊断标准[,,]，其中SMA 1型患儿18例(34.6%)，SMA 2型29例(55.7%)，SMA 3型4例(7.7%)，SMA 4型1例(1.9%)。入选病例均由其父母或监护人知情同意，本研究经首都儿科研究所伦理委员会批准(批准文号：SHERLL 2015003)。二、实验方法1．外周血DNA及RNA提取：收集52例患儿2～3 ml外周静脉乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，应用全基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)和总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)分别提取外周血DNA和总RNA。经NanoDrop 2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定核酸浓度后，DNA样本于-20 ℃保存，RNA样本于-80 ℃保存。2．SMN1基因缺失检测：利用聚合酶链反应(PCR)-Sanger测序检测SMN基因第7外显子初步判断SMN基因型。上下游引物分别位于第6内含子至第7内含子()，PCR产物包含SMN1与SMN2基因5个固有差异碱基中的4个，分别位于第6内含子(g.31957)、第7外显子(g.32006)以及第7内含子(g.32154和g.32269)。PCR产物纯化后由北京诺赛基因公司应用ABI3730自动测序仪完成测序。表1SMN基因各引物序列表1SMN基因各引物序列SMN E1F：GGG CGG CGG AAG TCG TCA237 R：TGA TGC TGT CCC GAG GCT SMN E2aF：TGT GTG GAT TAA GAT GAC TC241 R：CAC TTT ATC GTA TGT TAT C SMN E2bF：CTG TGC ACC ACC CTG TAA CAT G218 R：AAG GAC TAA TGA GAC ATC C SMN E3＋4F：TAT CCT TCA CCT CCC CAC T749 R：GCA TCA TTA TCT TAT TTC CT SMN E5F：ATC CTT TTG GTT TTG AGT CCT251 R：TTT ACA ATC CTC TAT TCT GCT SMN E6F：CCA GAC TTT ACT TTT TTG TTT ACT G196 R：GTC AGG AAA AGA TGC TGA GTG SMN E7F：TGT CTT GTG AAA CAA AAT GCT T459 R：AAA AGT CTG CTG GTC TGC CTA SMN E8F：AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC1 011 R：CTA CAA CAC CCT TCT CAC AG SMN575ACC CGC GGG TTT GCT ATG1 259SMN541c1120CTA CAA CAC CCT TCT CAC AG DNA序列分别与SMN1基因(GenBank：NG_)和SMN2基因(GenBank：NG_)参考序列进行比对，重点分析前述4个固有差异碱基位点，SMN1基因分别为G、C、A、A，而SMN2基因为A、T、G、G，并根据差异碱基峰高的变化判断SMN基因型：若仅存在SMN2基因的碱基峰，即可以判断SMN1基因纯合缺失；若SMN1基因碱基峰存在，但峰高明显低于SMN2基因，可以初步判断SMN1基因杂合缺失。3．SMN1基因点突变筛查：对于疑似SMN1基因杂合缺失的病例，应用PCR-Sanger测序检测SMN基因第1、2a、2b、3～6、8外显子、外显子与内含子交界区域(扩增引物如)。同理，针对差异位点之外的碱基变异，参考固有差异碱基处SMN1基因峰高明显低于SMN2基因，比较突变碱基峰高是否明显低于野生碱基，据此初步判断突变位点的基因来源。4．SMN1基因复合杂合突变验证：(1)验证SMN1基因杂合缺失：应用多重连接探针扩增(MLPA)技术，根据MLPA P021-A2试剂盒(荷兰MRC公司)使用说明检测SMN1基因和SMN2基因拷贝数。所得数据采用Coffalyser MLPA DAT 9.0软件进行分析，以SMN1和SMN2基因拷贝数均为2的正常人样品作为对照，根据比值计算其基因拷贝数：比值&0.3时，拷贝数为0；比值为0.3～0.7时，拷贝数为1；比值为0.7～1.3时，拷贝数为2；比值为1.3～1.7时，拷贝数为3；比值为1.7～2.3时，拷贝数为4。(2)验证SMN1基因点突变：定量500 ng总RNA，应用逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)合成cDNA，PCR扩增SMN基因(包含SMN1和SMN2基因)全部外显子区域和部分3'非翻译区序列(1 259 bp)，引物序列如[,]。所得产物分别与pGEM-T载体(美国Promega公司)相连后转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送北京诺赛公司进行序列测定。根据前述位于第7外显子上的固有差异碱基区分SMN1基因和SMN2基因，并以此判断突变位点的来源。5．诊断效率评估：由课题组标本库中随机选取基因型已知的15名正常人、15例SMN1纯合缺失型SMA和4例SMN1复合杂合突变型SMA患儿标本，根据双盲实验原则，由2名不同操作人员进行平行检测。除比较操作人员间的检测结果外，所得结果还要与已知基因型进行比较，用于所建方法诊断效率的评估。结果一、Sanger测序技术判断SMN基因缺失根据SMN1与SMN2基因的4处固有差异碱基峰判断SMN基因型，47例仅存在SMN2基因的碱基峰，为SMN1基因纯合缺失()；5例同时存在SMN1和SMN2基因碱基峰，但SMN1基因碱基峰高度明显低于SMN2基因，疑似SMN1基因杂合缺失(，)。图1SMN基因第7外显子Sanger测序图　箭头所示为SMN基因第7外显子g.32006处固有差异碱基位点，SMN1基因为C，SMN2基因为T；A图示SMN1基因非缺失型，差异位点处C碱基与T碱基峰高大致相同；B图示SMN1基因纯合缺失，差异位点处仅存在SMN2基因的T碱基峰；C图示SMN1基因杂合缺失型，SMN1基因的C碱基峰明显低于SMN2基因的T碱基峰；D图示SMN2基因杂合缺失型，SMN2基因的T碱基峰明显低于SMN1基因的C碱基峰图1SMN基因第7外显子Sanger测序图　箭头所示为SMN基因第7外显子g.32006处固有差异碱基位点，SMN1基因为C，SMN2基因为T；A图示SMN1基因非缺失型，差异位点处C碱基与T碱基峰高大致相同；B图示SMN1基因纯合缺失，差异位点处仅存在SMN2基因的T碱基峰；C图示SMN1基因杂合缺失型，SMN1基因的C碱基峰明显低于SMN2基因的T碱基峰；D图示SMN2基因杂合缺失型，SMN2基因的T碱基峰明显低于SMN1基因的C碱基峰图2Sanger测序筛查SMN基因复合杂合突变　上方测序图中箭头所示为SMN基因第7外显子g.32006处固有差异碱基位点，SMN1为C，SMN2为T，5例患儿的SMN1基因C碱基峰均明显低于SMN2基因T碱基峰；下方为SMN基因所有外显子序列Sanger测序图，箭头所示为SMN基因突变位点，5例患儿的突变碱基峰均明显低于野生碱基峰图2Sanger测序筛查SMN基因复合杂合突变　上方测序图中箭头所示为SMN基因第7外显子g.32006处固有差异碱基位点，SMN1为C，SMN2为T，5例患儿的SMN1基因C碱基峰均明显低于SMN2基因T碱基峰；下方为SMN基因所有外显子序列Sanger测序图，箭头所示为SMN基因突变位点，5例患儿的突变碱基峰均明显低于野生碱基峰二、Sanger测序技术筛查点突变对5例疑似SMN1基因杂合缺失的患儿，应用Sanger测序进一步检测其余外显子、外显子与内含子交界区域，结果显示5例患儿的SMN1基因很可能发生了点突变。Sanger测序结果显示5例患儿的SMN基因分别在非固有差异碱基位点处表现了碱基变异，且变异碱基峰高均低于野生型碱基，这相似于在固有差异碱基位点处SMN1基因碱基峰高低于SMN2碱基峰高()。依据国际标准基因变异命名原则，该5例患儿分别携带的突变信息如。病例1携带的c.22dupA(p.Ser8Lysfs*23)突变位于第1外显子，在cDNA第22位重复1个碱基A，该突变导致SMN蛋白第8位丝氨酸(AGT)变为赖氨酸(AAG)，为移码突变；病例2携带的c.40G&T(p.Glu14*)突变位于第1外显子，在cDNA第40位的G碱基被T碱基取代，该突变导致SMN蛋白的第14位的谷氨酸(GAG)突变为终止密码子(TAG)，为无义突变；病例3携带的c.43C&T(p.Gln15*)突变，位于第1外显子，在cDNA第43位的C碱基被T碱基取代，该突变导致SMN蛋白的第15位的谷氨酰胺(CAG)突变为终止密码子(TAG)，为无义突变；病例4携带的c.683T&A(p.Leu228*)突变，位于第5外显子，在cDNA第683位的T碱基被A取代，该突变导致SMN蛋白的第228位亮氨酸(TTA)突变为终止密码子(TAA)，为无义突变；病例5携带的c.863G&T(p.Gly279Glufs*5)突变，位于第7外显子剪接调控区域，在cDNA第863位的G碱基被T碱基取代，为剪接突变。该5例患儿突变碱基峰高度均明显低于野生碱基峰高度。表25例患儿携带的运动神经元存活基因突变表25例患儿携带的运动神经元存活基因突变例1第1外显子c.22dupAp.Ser8Lysfs*23移码突变例2第1外显子c.40G&Tp.Glu14*无义突变例3第1外显子c.43C&Tp.Gln15*无义突变例4第5外显子c.683T&Ap.Leu228*无义突变例5第7外显子c.863G&Tp.Gly279Glufs*5剪接突变三、复合杂合突变的验证1．SMN1基因杂合缺失：应用MLPA检测5例疑似SMN1基因杂合缺失患儿的SMN基因的拷贝数(SMN1：SMN2)，结果显示，其中1∶3的3例、1∶2的2例。5例患儿的SMN1基因拷贝数均为1，为SMN1基因杂合缺失。Sanger测序分析SMN1杂合缺失的结果与MLPA结果一致。2．SMN1基因点突变：克隆测序分析验证了5例患儿的突变点均来自于SMN1基因()。图3克隆验证Sanger测序图　上方测序图中箭头分别示SMN基因外显子克隆测序中第7外显子g.32006固定差异碱基位点处，5例患儿均为SMN1基因C碱基峰；下方测序图中箭头所示为同一克隆基因上检测出的突变位点，说明SMN基因的突变位点均来自SMN1基因图3克隆验证Sanger测序图　上方测序图中箭头分别示SMN基因外显子克隆测序中第7外显子g.32006固定差异碱基位点处，5例患儿均为SMN1基因C碱基峰；下方测序图中箭头所示为同一克隆基因上检测出的突变位点，说明SMN基因的突变位点均来自SMN1基因四、诊断效率的评估2名操作人员应用Sanger测序方法同时对34份样本进行检测，重点比较SMN基因第7外显子的差异位点。15份样本在差异位点处仅存在SMN2基因的碱基峰，为SMN1基因纯合缺失；15份样本同时存在近似等高的SMN1和SMN2基因碱基峰，为SMN1基因非缺失；4份样本SMN1基因碱基峰高度明显低于SMN2基因，疑似SMN1基因杂合缺失。4份疑似SMN1基因杂合缺失样本的点突变筛查结果显示：2例携带Ser8Lysfs*23，2例携带Leu228*突变，且相应的突变碱基峰明显低于野生碱基峰，提示该突变可能位于SMN1基因。2名操作人员的检测结果均一致，且所有样本的检测结果与已知基因型均一致。在抽样的34份样本中，基于Sanger测序的检测方法诊断效率达到100%。讨论自1995年SMN基因被Lefebvre定位以来，现已明确位于染色体5q11.2～13.3、全长27 000 bp的SMN1基因是SMA的主要致病基因，该基因编码含294个氨基酸的全长SMN蛋白[]。SMA的常规辅助检查包括肌电图、肌酸磷酸激酶、肌肉活检等，这些方法缺乏特异性，且活检为有创检查。基因诊断则能无创地检测致病基因SMN1基因的改变，已成为SMA确诊的金标准。虽然大部分SMA患儿存在SMN1基因纯合缺失，但是仍有相当一部分SMA患儿是由于SMN1基因复合杂合突变所致。因此，SMA基因水平的诊断即要适用于SMN1基因纯合缺失，同时也要适用于SMN1基因复合杂合突变。目前，广泛应用于SMA基因检测的方法有限制性片段长度多态性、实时定量PCR、变性高效液相色谱技术、MLPA等，这些方法主要用于SMN1基因纯合缺失的检测，而不适用于SMN1基因复合杂合突变的确诊。本课题组前期已建立了Sanger测序技术用于SMN1基因纯合缺失的诊断策略[]，该方法基于SMN1与SMN2基因高度同源的特性，利用单一PCR扩增同时包含SMN1与SMN2基因4个固有碱基差异位点的内含子6至内含子7区域，通过分析第7外显子差异位点处SMN1基因C碱基的有无，从而判断SMN1基因是否存在纯合缺失。本研究中47例SMN1基因纯合缺失患儿经Sanger测序技术均准确检出。进一步研究发现Sanger测序技术对于SMN1基因的杂合缺失具有提示作用，因此，本研究将该方法的应用拓展至SMN1基因复合杂合突变的筛查。该策略是通过比较SMN1与SMN2基因在扩增区域内的4个固有差异位点的碱基峰高低，初步判断SMN1基因的杂合缺失。在这4个差异位点中，第7外显子g.32006差异位点(SMN1 C/SMN2 T)位于编码区，是大部分基因诊断技术判断基因缺失的主要依据，故将此位点作为主要观察指标，即当此差异位点处同时存在SMN1和SMN2基因碱基峰，且SMN1基因碱基峰高度明显低于SMN2基因时，初步判断为SMN1基因杂合缺失。本研究的52例SMA患儿中，有5例提示存在SMN1基因杂合缺失，该SMN1基因杂合缺失情况均经MLPA实验得到证实。随后，本研究进一步分析了这5例疑似SMN1基因杂合缺失的患儿其余外显子、外显子和内含子交界区域以筛查保留的1个SMN1基因是否发生了点突变。Sanger测序显示5例患儿均发现了碱基变异，且相应的突变碱基峰显著低于野生碱基峰，结合位于第7外显子的SMN1基因特异碱基峰C显著低于SMN2基因特异碱基峰T，初步判断该复合杂合突变发生在SMN1基因。克隆测序证实这5例患儿的突变均位于SMN1基因，分别为c.22dupA(p.Ser8Lysfs*23)、c．40G&T(p.Glu14*)、c．43C&T(p.Gln15*)、c．683T&A(p.Leu228*)和c.863G&T(p.Gly279Glufs*5)突变。至此，该5例患儿被诊断为SMN1基因发生了复合杂合突变：1个SMN1等位基因缺失，另1个SMN1等位基因发生点突变。因此，本研究提示Sanger测序由于既能检测杂合缺失，也可以分析点突变，因而可以用于SMN1基因复合杂合突变的筛查。双盲实验也显出该方法具有良好的诊断效率。目前，国内外已报道的SMN1基因点突变有82种，其中在中国人群中共报道18种，且中国人群的突变谱与国外报道存在差异：中国人群所报道的SMN1基因点突变主要分布于第1外显子，以p.Ser8Lysfs*23最常见，p.Leu228*次之；而国外突变主要分布于第3外显子和第6外显子，以p.Arg133fs*15和p.Tyr272Cys等较为常见，SMN1基因不同突变类型及突变位置可以通过不同的机制影响SMN1基因的正常表达。本研究中经Sanger测序技术检测出的5例SMN1基因复合杂合突变患儿，其中c.22dupA(p.Ser8Lysfs*23)、c．40G&T(p.Glu14*)、c．43C&T(p.Gln15*)和c.683T&A(p.Leu228*) 4例突变均使SMN1基因产生1个提前终止密码子(PTC)。此类突变通常被认为可能导致SMN1基因转录出截短的mRNA，最终翻译出截短、无功能的SMN蛋白；同时也有实验证实含有PTC的突变还可以通过触发无义突变介导mRNA降解机制，在翻译起始即降解突变的mRNA，最终均导致全长SMN蛋白表达量下降而致病[,,]。c.863G&T(p.Gly279Glufs*5)突变位于SMN基因外显子7上，最早在韩国人群中报道，近期有关体外剪接分析的研究中显示[,]，该突变干扰了剪接激动蛋白Trα2β1与外显子剪接增强子元件的结合过程，致使大部分SMN1 mRNA产物跳跃第7外显子，且全长SMN蛋白表达减少，证实该突变是一个影响剪接的突变。总之，本研究的5例患儿因不同的SMN1基因复合杂合突变均导致SMN1基因不能正常表达出全长SMN蛋白或表达水平低下，最终引起与SMN1基因纯合缺失类型患儿相同的SMA典型临床表现。综上所述，SMN1基因复合杂合突变的确诊对SMA患儿临床诊断和后期的临床干预以及患儿家庭的再发风险评估至关重要。Sanger测序技术不仅可以用于SMN1基因缺失型SMA患儿的诊断，还能准确地判断SMN1基因杂合缺失及筛选出SMN1基因上存在的点突变，最终确定SMN1基因复合杂合缺失病例的诊断。因此，较其他检测技术而言，Sanger测序技术能较广泛地用于SMA不同类型的诊断，而且在用于SMN1基因复合杂合突变诊断中具有操作简便、经济实用、特异性强的特点，较适合在临床推广应用。参考文献[1]ShengYZ, XiongF, ChenYJ, et al. 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530021　南宁，广西医科大学第一附属医院儿科
首都儿科研究所遗传研究室
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530021　南宁，广西医科大学第一附属医院儿科
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肌萎缩，脊髓性；Sanger测序；运动神经元存活基因；复合杂合突变
国家自然科学基金
（500979）
首都卫生发展科研专项资助项目
出版日期：
收稿日期：
Sanger sequencing for the diagnosis of spinal muscular atrophy patients with survival motor neuron gene 1 compound heterozygous mutation
Yang&Lan,Cao&Yanyan,Qu&Yujin,Bai&Jinli,Wang&Hong,Jin&Yuwei,Han&Yunli,Song&Fang
Corresponding author: Han&Yunli,Song&Fang,
Email:,songf_
DOI: 10.3760/cma.j.issn.17.06.004
Cite as Natl Med J China, ): 418-423.
ObjectiveTo detect the subtle variant of survival motor neuron gene 1(SMN1) by Sanger sequencing, and to assess the value of Sanger sequencing for the diagnosis of spinal muscular atrophy(SMA) with compound heterozygous mutation of SMN1.MethodsFifty-two patients suspected SMA were recruited by the Capital Institute of Pediatrics from Jan.2014 to June.2016. PCR was used for amplifying exon7 of SMN1 and SMN2 in 52 patients. Natural different base peaks on the sequencing chromatogram in the SMN1 and SMN2 within the amplified segments were identified with Sanger DNA sequencing to detect the homozygous deletion or heterozygous deletion of SMN1. Then we screened the SMN1 subtle variants in heterozygous deletion patients by genomic Sanger sequencing for the other SMN exons. At last, multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA) was carried out to confirm the results of SMN1 heterozygous deletion, and T-A cloning confirmed the subtle variants were located in SMN1.ResultsForty-seven of 52 cases were homozygous deletion of SMN1, while 5 cases were heterozygous deletion which were confirmed by MLPA.Then, by genomic and T-A cloning sequencing, five SMN1 subtle mutations were separately identified in 5 cases of heterozygous deletion.ConclusionSanger sequencing is an effective method for the clinical diagnosis of compound heterozygous mutation of SMN1, and is meaningful for improving genetic diagnosis rate of SMA.
Key words Muscular atrophy, spinal,Sanger sequencing,Survival motor neuron gene,Compound heterozygous mutation
Contributor Information
Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Cao&Yanyan
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肌萎缩，脊髓性
Sanger测序
运动神经元存活基因
复合杂合突变
黄定明　四川大学华西口腔医学院口腔医学博士，教授、主任医师、博士研究生导师，四川大学华西口腔医学院牙体牙髓科主任，中华口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会委员，四川省口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会副主任委员，国际牙医师学院院士。曾留学日本大阪大学2年从事牙体牙髓病的病原微生物致病作用研究，赴香港大学、宾夕法尼亚大学进修现代根管治疗技术、牙根尖显微外科手术等牙髓及根尖周病的现代诊治技术和理论。主要从事口腔微生物致病机制及宿主防御修复机制研究，牙髓及根尖周病病因及其现代诊治技术的基础和临床研究，擅长疑难病例的诊治和处理。负责国家自然科学基金4项、省科委基金4项，承担国家"十五"科技攻关项目、国家卫生和计划生育委员会临床重点项目、国家临床重点专科建设项目等科研任务。现为Molecular Oral Microbiology、《国际口腔医学杂志》、《牙体牙髓牙周病学杂志》、《北京口腔医学》、《口腔生物医学杂志》编委。已发表论文六十余篇，SCI收录二十余篇，参编包括全国本科规划教材《牙体牙髓病学》和研究生规划教材《牙髓病学》等专著10部，获教育部科技进步一等奖、中华医学科技奖、四川省科技进步奖等6项。|周学东　1987年毕业于原华西医科大学，获医学博士学位；1987年赴丹麦奥尔胡斯皇家牙学院学习。现任四川大学教授、博士研究生导师，四川大学华西口腔医学院院长，口腔疾病研究国家重点实验室主任，国务院学科评议组成员，教育部高等学校口腔医学专业教学指导委员会主任委员，教育部高等学校口腔医学研究生教学指导委员会主任委员；国际牙医师学院（ICD）中国区主席、国际牙科研究会（IADR）中国区主席；中华口腔医学会副会长、中国医师协会口腔医师分会副会长、四川省口腔医学会会长，四川省医学会副会长、四川省医师协会副会长。主要从事龋病病因及防治的基础与应用研究，尤其对口腔微生物学、口腔生态学等领域有较深入的研究。先后主持国家重点基础研究发展计划（973计划）前期项目、自然科学基金重点项目、国家"十五"、"十一五"科技攻关项目、科技部国际合作项目、国家临床重点专科建设项目、四川省重点科技攻关项目等多项课题研究；主编《中华口腔科学》、《实用龋病学》、《实用口腔微生物学与技术》、《实用牙体牙髓病治疗学》、《口腔生态学》、《口腔生物膜与感染》、《口腔医学史》等学术专著与教材十余部，发表论文八十余篇，获部省级科技成果奖7项。主编International Journal of Oral Science、Bone Reseach、《中国口腔医学年鉴》。先后获得中国青年科技奖、四川省有突出贡献的中国博士、国家卫生和计划生育委员会有突出贡献的中青年专家、四川省学术技术带头人、四川省杰出创新人才奖、中国医师奖、国家教学名师奖，全国卫生系统先进个人等称号，1995年起享受国务院政府特殊津贴。}