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产绿孢子阿维链霉菌的遗传改造和发酵条件的研究
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阿维链霉菌孢子色素生物合成对阿维菌素产量影响.pdf 5页
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生物 工程 学报
ChinJBiotech2008，October25；24(10)：
journals．im．ac．cn
ChineseJournalofBiotechnology ISSN
cjb@im．ac．cn
@ 2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved
阿维链霉菌孢子色素生物合成对阿维菌素产量的影响
朱娟娟，陶美风
华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉 430070
摘 要：以野生型阿维链霉菌NRRL8165为出发菌株，用PCR方法克隆孢子色素基 因簇直系同源基因(whiEa)~]翼片段，
并构建基 因置换载体 pliL643。将 pliL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165，通过置换载体和染色体之间的同
源双交换，对染色体上的whiEa基因簇进行置换，得到 3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株，均表现为孢
子色素合成缺陷。通过Southern杂交分析，证明whiEa基 因簇被置换。通过摇瓶发酵和 HPLC检测。发现whiEa基因簇
置换菌株所产阿维菌素产量明显提高，表 明孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象。
关键词：孢子色素，whiE，阿维链霉菌，接合转移，基 因置换，阿维菌素
EffectonProductionofAvermectinsofSporePigment
BiosynthesisinStreptomycesavermitilisNRRL8165
JuanjuanZhu，andMeifengTao
StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China
Abstract：Theflankingfragmentsofthewh
geneclusterWaSPCRamplified，clonedandusedtoconstructhtegenereplacement
plasmidpHI_~ 3．pliL643wasconjugatedintoStreptomycesavermitilisNRRL8165followdebyscreennigfordoublecrossoverevent,
yieldingthreeapramycinresistancenadthiostreptonsensitiveisolatesnma de ZJ1，ZJ2andZJ3，whichweredeficientnibiosynthesisof
thegreyspore pigment．ThewhiEagenereplacementofhteseisolateswasconfirmde bySouthem hybridization．Fermentationofthe
mutantstrainsinshakingflasksandHPLCanalysesshowde htathteproductionofavermectinsnicreasedby47％ comparedwiht htatof
htewildtype，indicatinghtathtesporepimg entbiosynthesiscompeteswiht hteavermectinsbiosynhteticpahtway．
Keywords：sporepimg ent，whiE~，Streptomycesavermitilis，conjugation，genereplacement，avermectins
阿 维 菌 素 (Avermectin)是 由阿 维 链 霉 菌
趣。目前阿维菌素的生物合成途径 已基本阐
(Streptomycesavermitilis)NRRL8165产生的一组具
Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺人相应的 C
有相似结构的十六元大环内酯类抗生素，共 8个组
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海洋链霉菌
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海洋链霉菌，孢子丝1—4圈螺旋形，大部分紧密，少数松敞，有的直、曲或成钩状、环状。淀粉水解强。纤维素不分解。硝酸盐还原强。
海洋链霉菌形态
1—4圈螺旋形，大部分紧密，少数松敞，有的直、曲或成钩状、环状。孢子表面光滑
海洋链霉菌性态
蔗糖琼脂：气丝粉色。基丝反面浅暗淡粉色。葡糖硝酸盐琼脂：气丝暗淡粉色。葡糖天冬素琼脂：无气丝。无机盐淀粉琼脂(ISP)：气丝暗淡粉红色至灰粉色。基丝反面粉灰色至浅暗淡褐色。高氏合成1号：气丝暗淡粉色。基丝反面乳脂色至暗淡粉色。营养琼脂：气丝至淡粉色。酵母精麦芽精琼脂(ISP)：气丝粉色。燕麦粉琼脂(ISP)：气丝暗淡粉色。贝氏琼脂：气丝贫乏，粉色。伊氏琼脂：气丝少，淡粉色。马铃薯葡萄糖琼脂：无气丝。马铃薯块：基丝淡黄色至暗淡粉色。15天液化1/4。牛奶10天完全凝固，21天完全胨化。淀粉水解强。不分解。还原强。不产生类黑色素、酪氨酸酶和H2S。利用蔗糖、鼠李糖、以及半乳糖、甘露糖、菊糖、卫矛醇、醋酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠；对山梨醇利用可疑；不利用山梨糖。产生新霉素 (neomycin)复合体，抑制革兰氏阳性和阴性细菌、分枝杆菌。此菌未标明菌号，分离自孟加拉湾距海岸约100米的海水样。C1027-scFV在链霉菌中的融合表达研究--《2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集》2007年
C1027-scFV在链霉菌中的融合表达研究
【摘要】：目的:力达霉素是我所肿瘤室研究发现的一种高效抗肿瘤抗生素,它由110个氨基酸残基组成的辅基蛋白和烯二炔结构的发色团两部分构成。其中辅基蛋白对发色团的稳定起保护作用。本论文利用同源双交换的方法将力达霉素辅基蛋白与抗 IV 型胶原酶单链抗体 scFv 的融合基因取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA),以期得到得到既具有靶向性、又有抗肿瘤活性的 ScFV-力达霉素。方法:以大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒 pKC1139为基础构建同源双交换质粒 pBS-scFV。用接合转移的方法将双交换的质粒转入 Streptomyces globisporus C1027。利用抗性差异筛选发生双交换菌株。经 PCR 检测、southern blotting 对重组链霉菌菌株进行验证。以 C1027为阳性对照菌株,对验证正确的链霉菌菌株进行发酵。对发酵液进行抑菌活性初步测定。对发酵液蛋白以及链霉菌胞内蛋白进行 SDS-PAGE 分析。结果:经多次酶切验证正确的穿梭质粒经 ET12567成功转入链霉菌菌株,经抗性筛选得到 3个重组子。对其中一个重组子 C1027-scFV 进行 PCR 验证,结果正确。对 PCR 验证正确的重组菌株提取总 DNA 进行 southern 验证,结果正确。对重组菌株与野生菌株按相同条件进行发酵, 分别取第2、3、4、5天的发酵液进行抑菌圈活性检测,结果发现重组菌株 S．globisporus C-1027-scFv 发酵液在第五天能够检测到抑菌活性,但与 S．globisporus C-1027原株相比,其抑菌活性有很明显的减弱。SDS-PAGE 结果显示工程菌株不再产生辅基蛋白。初步结果表明重组菌株可产生与抗 IV 型胶原酶单链抗体 scFv 融合的力达霉素。结论:结果表明,本实验的基本思路是可行的。但重组菌株发酵液的抑菌活性很低。目前正在改变试验设计以期提高重组菌种的分泌活性。如果能继续优化试验方法和试验条件,得到高分泌活性的重组菌株,则具有很高的理论和实际应用意义。
【作者单位】：
【分类号】：R91【正文快照】：
C1027-scFV在链霉菌中的融合表达研究@李保卫$中国医学科学院医药生物技术研究所!北京100050
@胡云峰$中国医学科学院医药生物技术研究所!北京100050
@洪斌$中国医学科学院医药生物技术研究所!北京100050
@邵荣光$中国医学科学院医药生物技术研究所!
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杀念菌素高产菌株的构建（可编辑）,新菌株构建属于,克念菌素,嗜血菌株,乳酸菌素片,制霉菌素片,阿维菌素,伊维菌素,结核菌素试验,嗜血菌株第二季
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