本发明属于兽医检测技术领域，尤其涉及一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的ielisa方法。

我国是世界上绵羊和山羊饲养量、出栏量最多的国家，2017年存栏量达30231.7万只，但是羊在养殖过程中易出现多种呼吸道疾病，其中羊肺炎是临床上最常见的疾病，对养羊业的影响极大。羊肺炎可分为病毒性、细菌性、支原体性以及寄生虫性四种，在我国，临床上引起羊肺炎的支原体主要有两种：绵羊肺炎支原体(mycoplasmaovipneumoniae，mo)和山羊支原体山羊肺炎亚种(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，mccp)，这两种病原山羊和绵羊都能感染。

在进行针对mo和mccp两种病原的疫苗以及诊断技术的研究工作中，实验前期筛选阴性羊的准备工作和后期抗体水平变化的监测都需要用到血清学检测方法，除此之外一些临床样品也需要进行血清学初检。目前，可供选择的常用血清学方法包括：elisa，iha和cft等，但现有的elisa，iha和cft在检测mo或mccp抗体时存在如下缺陷：用于检测mccp抗体的celisa试剂盒虽然具有良好的敏感性和特异性，但价格昂贵，检测成本达40元/样本；iha每次需要致敏绵羊红细胞，这往往会导致批间重复性下降；cft的特异性和敏感性较差，甚至会出现感染羊检测结果呈阴性的现象。此外，这些方法均只能检测mo或mccp一种病原的血清学抗体，这意味着在筛选mccp和mo阴性羊时，必须进行两轮检测，花费大量人力物力，并不适用于大量样本的筛选工作。

针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的ielisa方法，其敏感性可达98％，具有操作简单、样本处理量大的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的ielisa方法，包括以下步骤：

(1)将山羊支原体山羊肺炎亚种1801菌株接于mtb培养基中扩培后，菌液离心、灭菌、pbs超声重悬，分离得到抗原；

(2)用所述抗原包被酶标板，每孔100μl，37℃温箱1h后4℃过夜；弃去包被液并用洗涤液洗涤，每孔加100μl封闭液，37℃封闭2h；加入100μl200倍稀释的血清样品，37℃孵育1h；用pbst洗板后，每孔加入100μl用5％脱脂奶粉稀释5000倍的兔抗羊二抗，37℃孵育1h；

(3)孵育后用pbst洗板，然后每孔加入100μltmb显色，37℃孵育10min；再加入终止液终止反应；将反应后的酶标板置于酶标仪上读取od450nm值。

优选地，所述抗原包被量为60ng/孔。

优选地，所述封闭液为5％脱脂奶粉。

本发明进一步提供了所述ielisa方法在筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种两种病原血清学阴性羊中的应用。

本发明进一步提供了所述ielisa方法在监测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体水平中的应用。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

本发明建立的筛选绵羊肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种血清学阴性羊的间接elisa(ielisa)方法，其敏感性可达98％，具有操作简单、样本处理量大的优点。由于该ielisa方法具有高度的敏感性，适用于mccp和mo两种病原血清学阴性羊的筛选工作；分析还发现这种方法可及时呈现实验过程中抗体水平的变化，与现用celisa试剂盒检测结果以及实验事实相符，这表明ielisa方法可应用于筛选mo和mccp阴性羊的研究工作中，以及实验中mccp抗体水平的监测。

图1是本发明实施例提供的ielisa与传统使用的celisa方法监测mccp抗体水平变化的结果图。图中：celisa077代表077号羊血清celisa检测结果(spi％)，以实线表示，而ielisa077代表077号羊血清ielisa检测结果(od450)，以虚线表示，以此类推。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

96孔酶标板，casein，bsa，脱脂奶粉，二抗(兔抗羊，sigma)，mccp抗体检测celisa试剂盒(idexx公司)，酶标仪，bca试剂盒等。菌种：mccp1801菌株，于中国农业科学院兰州兽医研究所保存。血清：采自疫苗/感染实验中不同时间点，共550份。

将实验室保存的山羊支原体山羊肺炎亚种(mccp)1801菌株接于mtb培养基中，37℃、1/10比例进行扩培，最终得到500ml菌液，10000×g离心20min收菌体，灭菌，0.01mpbs离洗5次，最后用20ml0.01mpbs重悬，超声重悬液，直到菌液变澄清，10000×g离心2min分离上清沉淀，上清分装保存于–40℃，并进行bca定量。

3、抗原抗体最佳工作浓度的选择

采用棋盘滴定法确定抗原抗体最佳工作浓度，具体过程如下：

包被抗原为步骤2所制备的，96孔酶标板第1列包被浓度为10μg/孔，每孔100μl，以0.05mph9.6的碳酸盐包被缓冲液依次进行2倍梯度稀释，最后一列(第12列)不包被抗原，37℃温箱孵育1h，再4℃过夜。用0.01mpbst洗板3次，5％脱脂奶粉100μl每孔，37℃封闭2h；0.01mpbst洗板3次，阳性血清依次进行50，100，200，400倍梯度稀释，分别加入第1到4行，阴性血清做同样的稀释，加入第5到8行，每孔100μl，37℃孵育1h；0.01mpbst洗板4次，兔抗羊二抗用5％脱脂奶粉5000倍稀释，100μl每孔，37℃孵育1h；0.01mpbst洗板4次，每孔加入100μltmb显色，37℃孵育10min；100μl2mh2so4每孔终止反应；将96孔酶标板置于酶标仪上读取od450nm值，然后计算相同稀释条件下p/n值(od阳性血清/od阴性血清)，取p/n值较大且阳性血清孔od值接近“1”的抗原抗体稀释度。

结果显示最佳抗原包被量为60ng/孔，条件：37℃温箱1h，然后4℃过夜；最佳血清的稀释度为1/200，条件：37℃温箱孵育1h。

在上述选择的最佳抗原抗体工作浓度条件下，分别用5％脱脂奶粉、2％bsa、casein作为封闭液，以0.01mpbst作未封闭对照，同时做血清空白孔，即仅孵育二抗，血清和二抗均用封闭液稀释，步骤同3。选择p/n值较高且阴性血清孔od值接近于血清空白孔的封闭条件。

结果显示最佳封闭液为5％脱脂奶粉，条件：37℃温箱孵育2h。

根据上述实验步骤，初步建立ielisa体系，用ielisa方法检测实验室保存的已知阴性血清276份，取95％置信区间，将阴性血清od450读数的均值(m)+2sd作为临界值，即odcut-off＝m阴性血清od+1.96×sd。根据spss分析，样本数据符合正态分布，根据公式m+1.96×sd：0.191+1.96×0.085＝0.357，确定cut-off值为0.36，当od值小于0.36时判为阴性。

6、阴性血清筛选能力评估

一共用550份血清对ielisa的阴性血清筛选能力进行评估，分别与常用的商品化mccp抗体检测celisa试剂盒(mccp-celisa)和mo抗体检测mo-ielisa试剂盒(mo-ielisa)的检测结果进行对比，并以这些结果作为参考，计算本发明ielisa方法的特异性和敏感性，以此判断本发明ielisa方法是否可作为筛选阴性血清使用。

550份血清中306份血清采自mccp疫苗实验，全部血清经过mccp-celisa检测；另244份血清采自mo感染实验，由mo-ielisa方法检测。本发明ielisa检测mccp疫苗实验所采集的血清时，以celisa结果作为参考，本发明ielisa检测mccp的敏感性为99.02％，特异性为76.47％，结果见表1。

同样，检测mo疫苗实验中采集的血清时，以目前常用的mo-ielisa检测结果作为参考，本发明ielisa检测mo的敏感性和特异性分别达98.71％和65.17％，结果见表2。

7、mccp抗体水平监测

取疫苗实验期间不同时间点的血清进行mccp抗体水平检测，本实验选择了免疫0天，免疫7天，攻毒0天(即免疫后1个月)，剖杀/死亡(即攻毒后1个月)四个时间点的血清，各时间点选择了5份血清，共计20份，分别用具有良好特异性和敏感性的现用商品化celisa试剂盒和本发明所建立的ielisa进行检测，观察两组结果反映的抗体变化趋势是否一致。

结果如图1所示，celisa结果以抑制百分比(spi％)表示，大于55％判为阳性，而ielisa的结果以od450值表示，小于0.36判为阴性。结果表明，本发明ielisa与现用的celisa检测结果相比，都可以反映出实验期间不同时间点上抗体水平，两者变化趋势相近，且免疫一周后都显示出抗体水平的上升甚至血清转阳。由此表明，ielisa也可以及时并准确的呈现mccp抗体水平的变化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。