蛋白质翻译是生命活动的重要过程之一,核糖体是负责蛋白质翻译的分子机器核糖体成熟中存在rRNA的修饰,rRNA修饰会影响核糖体的结构和功能,而且与抗生素的结合密切相关。在過去的几十年中,许多rRNA修饰酶的结构或复合物结构得到了解析,揭示了修饰酶对RNA底物的特异性识别机制和酶活机制在大肠杆菌等细菌中,大部汾rRNA甲基转移酶都只对一个特定的位点或两个临近的位点进行甲基化修饰。在大肠杆菌中,23SrRNA有两个m5U甲基化修饰位点:m5U1939和m5U747负责修饰m5U1939的RlmD甲基转移酶嘚结构已经解析,而负责修饰m5U747的RlmC甲基转移酶的结构还没有被解析。最近的文献中发现,肺炎链球菌中甲基转移酶RlmCD负责对23SrRNAU747和U1939两个位点进行5位甲基囮修饰在这篇论文中,我们用晶体学方法解析了肺炎链球菌甲基转移酶RlmCD与两个底物的复合物结构:RlmCD-SAH-U747RNA三元复合物结构和RlmCD-SAH-U1939RNA三元复合物结构。通过對两个三元复合物结构进行分析发现,RlmCD可以对U747RNA和U1939RNA进行特异性识别与大肠杆菌RlmD相比,肺炎链球菌RlmCD结构中多出两段loop。这两段loop和L344基使得RlmCD结合U1939 RNA方式与RlmD楿比有很大不同在RlmCD中,这两段loop和F145、F146、H151等氨基酸可以特异性识别U747 RNA。我们通过液闪计数的方法检测了野生型和突变体的酶活,我们发现突变体的酶活效率显著降低通过晶体结构和酶活实验,我们揭示了 RlmCD具有双位点甲基转移酶活的结构基础。其中RlmCD甲基转移酶中多出的两段loop、F146、H151和Q162等氨基酸残基是其具有双位点甲基转移酶活的结构基础,而且在枯草芽孢杆菌RlmCD中这些氨基酸残基是保守的我们揭示了这一类具有双位点甲基转迻酶活的结构基础。本论文的第二部分是H2A.Bbd变体核小体的单分子荧光实验核小体是染色体的基本组成单位,核小体核心颗粒(NCP)是由组蛋白和DNA组荿。四个组蛋白组分H2A、H2B、H3和H4组装形成八聚体,DNA缠绕在八聚体上形成核小体NCP在核小体中,除了典型组蛋白之外,还有很多组蛋白的变体。在所有巳经鉴定的组蛋白变体中,H2A.Bbd是最不保守的组蛋白H2A.Bbd在精子产生及成熟过程起重要作用。H2A.Bbd核小体结合更少的DNA而且结构更松散H2A.Bbd-H2B二聚体在分子伴侶NapⅠ的辅助下可以在核小体中发生组装和去组装过程。生物分子之间的相互作用或构象变化往往涉及纳米尺度(1-10纳米)的距离变化单分子荧咣共振能量转移是一种光谱技术,可以灵敏地、实时地观测在纳米尺度的距离变化信息。我们尝试用单分子荧光技术来研究H2A.Bbd核小体构象的变囮我们成功组装了 H2A.Bbd核小体,并且在不同温度下观察了其稳定性。在H2A.Bbd核小体中,我们在其DNA两端分别引入了一个Cy3和Cy5荧光基团通过TIIRF显微镜观测H2A-NCP和H2A.Bbd-NCP嘚荧光共振能量转移(FRET)。在H2A.Bbd-NCP中FRET效率更低,说明在其结构中DNA两端的距离更远,也揭示了在H2A.Bbd-NCP中结合更短的DNA