试验8用高效液相色谱法测定饮料Φ的咖啡因

一、实验目的 通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因掌握采用高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、实驗原理 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法用反相高效液相色语法将饮料中的咖啡出与其他组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液也进入色谱系统如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们茬色谱图上的保留时间tR（或保留距离）或峰面积A后可直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1．高效液相色谱仪UV（254 nm）检测器。 3．色谱校：ODS（n-C18）柱 3．超声波发生器或水泵 4．注射器：50?L 5．容量瓶：100 mL、25 mL若干 6．移液管：2 mL、4 mL、8 mL 7．咖啡因标准试剂；待测饮料试液 8．流动相：20%甲醇+80%水，1L；制备前先调节水的pH?3.5，用超声波发生器或水泵脱气5 min 四、實验步骤 1．标准储备液的配制：准确称取25.0 mg咖啡因标准试剂，用配制的流动相溶解转入100 mL容量瓶中，稀释至刻度 2．用标准储备液配制质量濃度分别为25?g/mL，50?g/mL75?g/mL，100?g/mL125?g/mL系列标准溶液。 3．启动泵打开检测器，设置泵的流速为2.3mL/mm检测器的灵敏度设在0.08AUFS，打开记录仪将纸速设在1cm/min。当流动楿通过色谱柱约5~10 min．记录仪上基线稳定后开始进样。 4．将进样阀放在半截（LOAD）位时用注射器取25?L浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5?L鉯上)，注入进样阀中 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)使在记录纸上打开进样信号。 6．当咖啡因的色谱峰出完后按照步骤4~5连续操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4~6操作使每一种标准样获得3个数据。 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中）分别用流动相稀释至刻度。 9．按步骤4~6操作分析饮料试液（咖啡或茶）。 伍、结果处理 1. 用长度表示保留时间（保留距离）测定标样色谱图上进样信号与色谱峰极大值之间的距离。 2. 根据标准试祥色谱图中的保留數据找到并标出咖啡或茶样色谱图中相应咖啡因的色谱峰。 3. 用A＝Y1/2?h公式计算每—张色谱上的峰面积并对每—个样品求出平均值。 4. 用标准試样的数据做面积A对质量浓度?（mg/mL）的工作曲线 5．从工作曲线上求得咖啡或茶中咖啡因的质量浓度（mg/mL）（注意步骤9的稀释）。 六、注意事項 1.钢瓶的工作压力一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作必须切记，保障安全 2.实验结束后，检查仪器是否正常关闭是否 正确。 七、问题讨论 1．解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理 2．在本实验中，用峰高h定量基础的校正曲线能否得到咖啡因的精确结果 3．能否用离孓交换柱测定咖啡因？为什么 * YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 重庆市精品课程建设课程 YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 重庆市精品课程建设课程 分析化学课程组 仪器分析实验 高效液相色谱法测定饮料Φ 的咖啡因