教学问题：教材上DNA连接酶能催囮具有5突出粘性末端端DNA分子的连接形成磷酸二酯键，能不催化平末端呢

样品（甲）经 EcoRⅠ酶切后，在 DNA 连接酶催化下形成产物乙（如图） 則反应液中产物乙共有

分析：此题和得分率只有28.3%,是选择题中最低的，说明学生在这方面还有欠缺上述试题由于讲清楚是限制性核酸内切酶 EcoRⅠ，所以不会催化平末端的连接

 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO₄与叧一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外）而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶二者的作用机理类似。

1．大肠杆菌的DNA连接酶

DNA连接酶在大腸杆菌细胞中约有300个分子和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双鏈DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组

另外，NH4Cl可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率而对T4DNA连接酶则无效。

2．T4DNA连接酶作用机制：

（1）T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物

（2）酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化

（3）产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来

分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。

T4DNA连接酶连接要求和结果