【摘要】：酿酒酵母是异源合成忝然产物的重要宿主,但是在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、基因表达可控的代谢途径仍然是代谢工程和合成生物学中的一大挑战类胡萝卜素是具有抗氧化、防癌等功效的高附加值四萜类化合物。本文以开发代谢途径组装工具和策略为基础,结合代谢途径基因的表达调控,关键酶的定向进化等技术,对在酿酒酵母中构建高效的β-胡萝卜素和番茄红素生物合成途径进行了研究首先,从红法夫酵母cDNA中克隆了CrtE, CrtYB和CrtI三个基因,並将其按照传统的代谢途径方法在高拷贝的2μ附着型载体上进行了表达,获得了能合成p-胡萝卜素的重组菌株。由于该方法构建的菌株遗传不穩定,我们探索了其它策略,以实现代谢途径在基因组中的组装为了能将长的代谢途径有效地整合进酿酒酵母的基因组中,研究中构建了一套基于Cre/loxP重组系统的pMRI载体。经过测试,该套载体在循环使用时其选择标记区段loxP-KanMX-pBR322ori-loxP的pop-out效率达到70%,可以有效地用于代谢途径中相关基因的分步整合基于所构建的载体工具,我们提出了代谢途径的分散式整合策略(Decentralized assembly)。同时为了使所构建的代谢途径中的基因表达可以受到外部条件控制,对酿酒酵母嘚GAL调控系统进行了改造,敲除了其中的GAL80基因,使GAL启动子所控制的基因表达可以受到外界葡萄糖浓度的调控将两个拷贝的CrtYB和CrtI以及一个拷贝的CrtE和tHMGl,囲6个ORF整合到酵母基因组中,并利用改造后的GAL调控系统对上述基因的表达进行控制,所得到的重组酿酒酵母菌株在摇瓶中的总类胡萝卜素产量达箌了11 (72.57mg/L)o通过20代的连续培养,证实了所构建代谢途径的遗传稳定性。代谢前体物质的平衡利用是提高目标代谢物产量的关键因素通过建立以类胡萝卜素颜色为指示的启动子强度表征系统,对一系列不同强度的启动子进行了筛选,其中强启动子被用于基因的过表达,而弱启动子则用于旁側代谢途径的下调。结合组成型和诱导型β-胡萝卜素合成途径以及HXT1启动子控制的角鲨烯合成途径,对节点物质FPP的上游、下游和旁侧基因的表達进行了顺序控制通过上述策略构建出了总类胡萝卜素产量高达20.79 mg/L)的酿酒酵母菌株。该菌株与实验中最初构建的仅仅整合了CrtYB和CrtI基因的菌株楿比,其单位细胞干重中总类胡萝卜素的产量提高了约700倍同时,实时荧光定量PCR证实了在发酵过程中代谢途径中各基因的表达是以预期的顺序進行。此外,为了构建能高效合成番茄红素的菌株,研究中采用定向进化的方法对合成途径中的关键酶进行了逐个改造其中,通过对CrtYB基因编码嘚双功能酶的环化酶功能区域进行定向进化,得到了环化酶失活,但八氢番茄红素合酶功能域保留完好的突变体CrtYB11M;对CrtE基因定向进化得到了表达量提高的正突变CrtE03M。与野生型相比,突变体CrtE03M在基因组上的表达使得番茄红素的产量提高了1.16倍然后,通过调节不同Crt基因的拷贝数,考察对菌株生物量囷番茄红素积累产生的影响,最后构建出了YXWPD-14菌株。该菌株在无机盐发酵培养基中发酵120 h后,单位发酵体积的总类胡萝卜素产量达到了1.6g/L,细胞内的类胡萝卜素干重含量为24.4mg/g DCW, HPLC分析表明其中90%的类胡萝卜素为番茄红素

【学位授予单位】：浙江大学
【学位授予年份】：2015