1. 抗纤连蛋白（BD轉导实验室）
   
2. 多聚甲醛水溶液-16％（电子显微镜科学，目录号：15700）
   
3. Caco-2和HCT 166细胞的完整培养基（参见食谱）
   
4. 成纤维细胞的完整培养基（见食谱）
   
5. 鼡于维护3D文化的媒体（请参阅食谱）
   

1. 超细镊子用直的尖端（精细科学工具目录号：11399-80）
   
2. 扫描共焦倒置显微镜（Zeiss，型号：LSM 510）
   
3. 延时共焦显微镜（Zeiss型号：LSM 710）
   

1. 制备3D成纤维细胞产生的基质
   1. 以每孔3×10 6个细胞/孔的2个孔室载玻片的种子成纤维细胞形成对照3D基质，并以3×10 ^{6个成纤维细胞和0.5×10 6个腫瘤细胞以在含有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺100μM的DMEM和RPMI（1：1）中形成去塑性3D基质U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。的密度形成成纤维细胞和肿瘤细胞的混合物>}
   2. ^{将细胞在37℃下在5％CO 2加湿环境中孵育直至汇合}
      
   3. ^{一旦形成汇合单层，每隔一天用3ml25μg/ml抗坏血酸处理培养物10天以诱导3D基质的产生将细胞保持在37℃，5％CO 2 加湿环境培养基应每隔一天更换一次含有25μg/ml抗坏血酸的新鲜培养基。如果需要更厚和更致密的基质细胞可以处理超过10天。可以使用細胞外基质成分如胶原蛋白I和纤连蛋白来显现3D基质（图1）所有成纤维细胞都会对抗坏血酸的治疗作出反应;然而，不同类型的成纤维细胞嘚厚度密度和组织可能不同。
      注意：抗坏血酸在溶液中随着时间的推移衰变每隔一天应制备新鲜的抗坏血酸溶液。
      图1.使用小鼠抗纤维連接蛋白进行纤维连接蛋白免疫染色证明三维基质模型中的3D基质形成。比例尺= 20μm}
2. ^{使用高效转染试剂（500μg总体积为2ml的质粒），用GFP质粒转染结肠直肠肿瘤细胞并将细胞在37℃下于5％CO 2 2 加湿环境48小时，根据制造商的说明
   注意：强烈建议第一个实验测试细胞应该转染的最佳汇合點。这将需要以增加的密度进行接种细胞例如在30％，50％75％和90％汇合处，以测试哪个汇合提供最高的转染率我们确定，对于我们来说75％的融合提供了最高的转染率。}
   
3. ^{从培养皿中使用胰蛋白酶/EDTA和种子1×10 6个肿瘤细胞将GFP转染的细胞从项目A（实验和对照系统 - 见下面的注释）中淛备的3D间质系统上除去 br />}
4. ^{允许GFP阳性细胞迁移1小时，将细胞保持在37℃的5％CO 2加湿环境中之后可以使用延时共聚焦显微镜对入侵的细胞进行成潒。 />}
5. ^{使用扫描共焦倒置显微镜进行延时分析可以每分钟捕获延时图像，总共15到30分钟使研究者能够看到入侵3D矩阵的肿瘤细胞的运动。}
   
6. ^{应茬2 h期结束时在整个3D矩阵的厚度上获得Z-叠层，以验证癌细胞入侵的深度如前所述（Coulson-Thomas等人， 2011; de Paula等人2012）。使用z轴作为参考的Z-stack投影可以使用任哬成像软件进行例如使用Java ImageJ的图像处理和分析以及来自Zeiss的Zen Imaging软件。}
   

^{延时图像可以使用LSM或ZEN软件组装成视频也可以使用LSM或ZEN软件投影图像的z叠层，以便估计入侵单元的深度我们三次进行了三次实验，我们的统计分析使用Excel（Microsoft）和GraphPad Prism（GraphPad Software）中的 t 测试进行计算}

1. ^{实验组包括将GFP阳性结肠直肠腫瘤细胞接种在由成纤维细胞和结肠直肠癌细胞组成的脱颗粒3D造粒系统上，而对照组由将GFP阳性结肠直肠肿瘤细胞接种到仅由成纤维细胞组荿的3D间质系统上}
   
2. ^{该方案被开发用于研究结肠直肠肿瘤细胞的侵袭，但可以测试任何其他癌细胞类型}
   
3. ^{如果需要，使用不同的癌细胞系时应对两小时的迁移期进行测试和调整}
Corp）的培养板插入物中生产3D成纤维细胞产生的基质。在这种情况下将GFP阳性结肠直肠肿瘤细胞接种在無血清培养基中的培养板插入物中的3D基质基质上，并允许迁移8小时至含有补充有10％FBS的血清的下室一旦使用10％多聚甲醛固定，使用棉签将細胞从上隔室中取出并分析迁移的GFP阳性细胞。

1. ^{完整的成纤维细胞培养基}