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利用Cre-loxP自动敲除AIV+H5+HA重组鸡痘病毒中的报告基因.pdf 69页
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山东农业大学
硕士学位论文
利用Cre-loxP自动敲除AIV H5 HA重组鸡痘病毒中的报告基因
姓名：高月花
申请学位级别：硕士
专业：预防兽医学
指导教师：崔言顺
关于学位论文原创性和使用授权的声明
本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进
行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指
导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确
说明。本声明的法律责任由本人承担。
本人完全了觯山东农业大学有关保留和使用学位论
文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机
构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分
内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或
其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。
保密沦文在解密后应遵守此规定。
论文作者签名 盈碰
导师签名 拯u写
山东农业人学删I。学位论文
英文缩略表
利用cre—loxp自动敲除AIvHA晕纽鸡疱嫡毒中的报告基I划
在重组毒构建过程中，为了便于筛选和纯化，常常需要绿色荧光蛋白、
Lacz等筛选标记，构建好的重组病毒基因组中含有这些报告基因，不符
合商业疫苗生物安全的要求和基因工程疫苗的种毒标准。因此，将重组体
中的报告基因去除是非常重要的内容。本研究利用Cre一』。印系统去除了
重组毒的报告基因，最终获得了只含表达禽流感病毒(AIv)H5亚型血
凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒，并对其进行了初步的免疫效力测定。主
要研究内容如下：
1．禽痘病毒通用转移载体的构建
小的禽痘病毒F30序列作为同源重组臂。将含痘病毒早晚期启动子的绿色
荧光蛋白基因插入F30序列基因构建转移载体，通过首次转染、筛选，获
得了表达GFP的重组禽痘病毒。二次转染过程中通过cre重组酶，去除了重
组病毒基因组的GFP基因，达到了去除报告基因的目的。实验结果表明，
以GFP作为筛选标汜使重组病毒的纯化更为简便，同时利用cre一如舻系统
可以轻松地去除报告基因，为目的基因重组禽痘病毒的构建创造条件。
2．表达禽流感病毒H5血凝素重组禽痘病毒的构建
以含HA基因pH308为模板，通过PCR扩增了H5亚型禽流感病毒HA基因，
HA基因表达盒。将H5血凝
构建含禽痘病毒复合启动子、sV40P01yA的H5
素基因和GFP基因表达盒克隆入禽痘病毒F30基因构建了转移质粒载体
DPH5，将转移质粒载体与腊质体混合转染已感染FPV282E4株的CEF细胞，
利用免疫荧光初次筛选了表达H5和GFP的禽痘病毒重组体。通过二次转染，
利用cre一￡泖系统自动敲除重组病毒中的GFP基因，最终获得了只含H5
血凝素基因表达盒的重组禽痘病毒。免疫荧光和病毒复制效率测定结果表
明，经过6次传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5衄凝素。
3．表达H5亚型HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力测定
将sPF鸡随机分组，经翅下刺种禽流感病毒H5血凝素重组禽痘病毒疫
苗，接种量分别为105PFU和2×lO。PFU，并设禽痘病毒和生理盐水对照组，
山东农业大学瑚士学位论文
免疫后28天，两个重组禽瘸病毒免疫缀都有约70％的阳性率，结粜裂明重
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