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紧急求助:请高手看一下我的引物对吗?
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这个帖子发布于12年零335天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我打算用人的heme oxygenase-1cDNA做目的基因做基因治疗.heme oxygenase-1基因序列如下:1 tcaacgcctg cctcccctcg agcgtcctca gcgcagccgc cgcccgcgga gccagcacga
61 acgagcccag caccggccgg atggagcgtc cgcaacccga cagcatgccc caggatttgt
121 cagaggccct gaaggaggcc accaaggagg tgcacaccca ggcagagaat gctgagttca
181 tgaggaactt tcagaagggc caggtgaccc gagacggctt caagctggtg atggcctccc
241 tgtaccacat ctatgtggcc ctggaggagg agattgagcg caacaaggag agcccagtct
301 tcgcccctgt ctacttccca gaagagctgc accgcaaggc tgccctggag caggacctgg
361 ccttctggta cgggccccgc tggcaggagg tcatccccta cacaccagcc atgcagcgct
421 atgtgaagcg gctccacgag gtggggcgca cagagcccga gctgctggtg gcccacgcct
481 acacccgcta cctgggtgac ctgtctgggg gccaggtgct caaaaagatt gcccagaaag
541 ccctggacct gcccagctct ggcgagggcc tggccttctt caccttcccc aacattgcca
601 gtgccaccaa gttcaagcag ctctaccgct cccgcatgaa ctccctggag atgactcccg
661 cagtcaggca gagggtgata gaagaggcca agactgcgtt cctgctcaac atccagctct
721 ttgaggagtt gcaggagctg ctgacccatg acaccaagga ccagagcccc tcacgggcac
781 cagggcttcg ccagcgggcc agcaacaaag tgcaagattc tgcccccgtg gagactccca
841 gagggaagcc cccactcaac acccgctccc aggctccgct tctccgatgg gtccttacac
901 tcagctttct ggtggcgaca gttgctgtag ggctttatgc catgtgaatg caggcatgct
961 ggctcccagg gccatgaact ttgtccggtg gaaggccttc tttctagaga gggaattctc
1021 ttggctggct tccttaccgt gggcactgaa ggctttcagg gcctccagcc ctctcactgt
1081 gtccctctct ctggaaagga ggaaggagcc tatggcatct tccccaacga aaagcacatc
1141 caggcaatgg cctaaacttc agagggggcg aaggggtcag ccctgccctt cagcatcctc
1201 agttcctgca gcagagcctg gaagacaccc taatgtggca gctgtctcaa acctccaaaa
1261 gccctgagtt tcaagtatcc ttgttgacac ggccatgacc actttccccg tgggccatgg
1321 caatttttac acaaacctga aaagatgttg tgtcttgtgt ttttgtctta tttttgttgg
1381 agccactctg ttcctggctc agcctcaaat gcagtatttt tgttgtgttc tgttgttttt
1441 atagcagggt tggggtggtt tttgagccat gcgtgggtgg ggagggaggt gtttaacggc
1501 actgtggcct tggtctaact tttgtgtgaa ataataaaca acattgtctg我打算用RT-PCR从mRNA得到我的目的基因,我设计的引物是:
sense:5-agcacgaacgagcccagcac-3antisense:5-ggtaaggaagccagccaagag-3请各位帮我分析一下可行吗?是否还有更好的选择?我等着急用,谢谢!!!
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以上的基因序列是基因组还是cDNA序列呢？如果做RT－PCR应该选择cDNA序列，除了遵循一般的引物设计原则（自身不互补，两个引物不能形成引物二聚体，GC含量，碱基均匀分布等，这些知识在很多网站都可查到，不赘述）外，还应该注意以下几个方面：1，引物最好是跨越两个外显子区，至少有一条引物，这样可以防止基因组DNA污染，当然如果有基因组DNA污染时，扩增片断包括了内含子，片断应该大于从mRNA为模板扩增而来的片断，但如果其内含子bp数比较小时，就不易区分了，所以在引物设计上注意这点就可以避免了。2，引物的3‘端最后一个碱基最好不要停留在密码子的第三位，因为这个位置称为摇摆碱基，可能会有错配而影响扩增效率。3，一般扩增片断扩增200－300左右可能跑胶时好观察，当然这点不一定要满足。
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没有仔细检查您的模板，大概blast了一下。引物还可以，唯一不好的地方是有一个错配。自己看一下吧。
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非常感谢ZJhan
和笑佛两位!我要做的是用人的heme oxygenase-1基因做目的基因做基因治疗.我在NCBI中Nucleotide中输入human oxygenase-1后得到:1: NM_002133. Homo sapiens heme...[gi:4504436]
Links LOCUS
PRI 23-AUG-2004DEFINITION
Homo sapiens heme oxygenase (decycling) 1 (HMOX1), mRNA.ACCESSION
NM_002133VERSION
GI:4504436KEYWORDS
Homo sapiens (human)
Homo sapiens
E M C C V E
M E P C H Homo.FEATURES
Location/Qualifiers
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/chromosome="22"
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go_component: membrane fraction [goid 0005624] [evidence
TAS] [pmid 3345742];
go_component: endoplasmic reticulum [goid 0005783]
[evidence TAS] [pmid 3345742];
go_function: oxidoreductase activity [goid 0016491]
[evidence IEA];
go_function: signal transducer activity [goid 0004871]
[evidence IMP] [pmid ];
go_function: heme oxygenase (decyclizing) activity [goid
0004392] [evidence TAS] [pmid 9884342];
go_process: heme oxidation [goid 0006788] [evidence IEA];
go_process: positive regulation of I-kappaB
kinase/NF-kappaB cascade [goid 0043123] [evidence IMP]
/codon_start=1
/product="heme oxygenase (decyclizing) 1"
/protein_id="NP_"
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/translation="MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTR
DGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQ
EVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSS
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ELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTRSQAPLLRWVLTLSF
LVATVAVGLYAM"
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/gene="HMOX1"
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/gene="HMOX1"
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481 acacccgcta cctgggtgac ctgtctgggg gccaggtgct caaaaagatt gcccagaaag
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1501 actgtggcct tggtctaact tttgtgtgaa ataataaaca acattgtctg从81-944序列得到的氨基酸与上面一致,共288个,与我查的一篇文献讲的heme oxygenase-1由288个氨基酸组成一致,不知这是不是我所需目的基因的cDNA序列呢?为了能和病毒载体相连,我要在上面的引物中加入BamH1和Hind111两个酶切位点.然后用此引物经RT-PCR是否可以从mRNA得到我所需的含目的基因(81-944)的片段呢?如果不行,那我的引物该如何设计呢?有人建议我从81和947两端开始设计引物,不知这两种方法哪一个好些?另外做分子克隆还有什么其它的需注意?请两位给我具体一点的建议.谢谢!
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,请问你讲的"1，引物最好是跨越两个外显子区，至少有一条引物，这样可以防止基因组DNA污染，"这我不太明白.就我的这个基因,我要扩增含81-947这一段的片段,我该如何设计引物以满足上面的条件呢?谢谢指教!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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引物要位于不同的外显子上主要目的是让引物中间有段内含子序列，这样DNA和RNA PCR出来的条带大小不一样。就可以很方便的消除基因组DNA的污染 。你根据这个原则去设计，应该问题不大的
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那我以mRNA为摸板,经RT-PCR来扩增得到cDNA.我的引物设计时也要让引物位于不同的外显子上吗?mRNA上还存在内含子吗?若有,我该如何区分那是外显子那是内含子呢?
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那我以mRNA为摸板,经RT-PCR来扩增得到cDNA.我的引物设计时也要让引物位于不同的外显子上吗?mRNA上还存在内含子吗?若有,我该如何区分那是外显子那是内含子呢?
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您做RT－PCR，不需要管内含子还是外显子，mRNA里已经没有这些东西了，如果是以基因组DNA为模板做PCR，才有可能设计到内含子、外显子。你一开始就讲的很清除是做RT-PCR，怎么又糊涂了？：）
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非常感谢笑佛及其他高人!!!此外,在我开始上面设计的引物上加入酶切位点后得到最终的引物序列,sense的5'端加BamH1酶切位点ggatcc,antisense5'端加Hind111酶切位点aagctt,而ata和 cgc为保护性碱基.
如下:sense:5-ata ggatcc agcacgaacgagcccagcac-3antisense:5-cgc aagctt ggtaaggaagccagccaagag-3用这对引物经RT-PCR从mRNA能得到我的目的基因吗?请各位帮我分析一下可行吗?是否还有更好的选择?我等着急用,谢谢!!!
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61 acgagcccag caccggccgg atggagcgtc cgcaacccga cagcatgccc caggatttgt
121 cagaggccct gaaggaggcc accaaggagg tgcacaccca ggcagagaat gctgagttca
181 tgaggaactt tcagaagggc caggtgaccc gagacggctt caagctggtg atggcctccc
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721 ttgaggagtt gcaggagctg ctgacccatg acaccaagga ccagagcccc tcacgggcac
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1081 gtccctctct ctggaaagga ggaaggagcc tatggcatct tccccaacga aaagcacatc
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1501 actgtggcct tggtctaact tttgtgtgaa ataataaaca acattgtctg我打算用RT-PCR从mRNA得到我的目的基因,我设计的引物是:
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以上的基因序列是基因组还是cDNA序列呢？如果做RT－PCR应该选择cDNA序列，除了遵循一般的引物设计原则（自身不互补，两个引物不能形成引物二聚体，GC含量，碱基均匀分布等，这些知识在很多网站都可查到，不赘述）外，还应该注意以下几个方面：1，引物最好是跨越两个外显子区，至少有一条引物，这样可以防止基因组DNA污染，当然如果有基因组DNA污染时，扩增片断包括了内含子，片断应该大于从mRNA为模板扩增而来的片断，但如果其内含子bp数比较小时，就不易区分了，所以在引物设计上注意这点就可以避免了。2，引物的3‘端最后一个碱基最好不要停留在密码子的第三位，因为这个位置称为摇摆碱基，可能会有错配而影响扩增效率。3，一般扩增片断扩增200－300左右可能跑胶时好观察，当然这点不一定要满足。
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没有仔细检查您的模板，大概blast了一下。引物还可以，唯一不好的地方是有一个错配。自己看一下吧。
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非常感谢ZJhan
和笑佛两位!我要做的是用人的heme oxygenase-1基因做目的基因做基因治疗.我在NCBI中Nucleotide中输入human oxygenase-1后得到:1: NM_002133. Homo sapiens heme...[gi:4504436]
Links LOCUS
PRI 23-AUG-2004DEFINITION
Homo sapiens heme oxygenase (decycling) 1 (HMOX1), mRNA.ACCESSION
NM_002133VERSION
GI:4504436KEYWORDS
Homo sapiens (human)
Homo sapiens
E M C C V E
M E P C H Homo.FEATURES
Location/Qualifiers
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/chromosome="22"
/map="22q13.1"
/gene="HMOX1"
/note="synonyms: HO-1, bK286B10"
/db_xref="GeneID:3162"
/db_xref="LocusID:3162"
/db_xref="MIM:141250"
/gene="HMOX1"
/EC_number="1.14.99.3"
/note="go_component: microsome [goid 0005792] [evidence
go_component: membrane fraction [goid 0005624] [evidence
TAS] [pmid 3345742];
go_component: endoplasmic reticulum [goid 0005783]
[evidence TAS] [pmid 3345742];
go_function: oxidoreductase activity [goid 0016491]
[evidence IEA];
go_function: signal transducer activity [goid 0004871]
[evidence IMP] [pmid ];
go_function: heme oxygenase (decyclizing) activity [goid
0004392] [evidence TAS] [pmid 9884342];
go_process: heme oxidation [goid 0006788] [evidence IEA];
go_process: positive regulation of I-kappaB
kinase/NF-kappaB cascade [goid 0043123] [evidence IMP]
/codon_start=1
/product="heme oxygenase (decyclizing) 1"
/protein_id="NP_"
/db_xref="GI:4504437"
/db_xref="GeneID:3162"
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/db_xref="MIM:141250"
/translation="MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTR
DGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQ
EVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSS
GEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQ
ELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTRSQAPLLRWVLTLSF
LVATVAVGLYAM"
misc_feature
/gene="HMOX1"
/note="heme binding site"
misc_feature
/gene="HMOX1"
/note="Region: transmembrane domain"
polyA_signal
/gene="HMOX1"
polyA_site
/gene="HMOX1"ORIGIN
1 tcaacgcctg cctcccctcg agcgtcctca gcgcagccgc cgcccgcgga gccagcacga
61 acgagcccag caccggccgg atggagcgtc cgcaacccga cagcatgccc caggatttgt
121 cagaggccct gaaggaggcc accaaggagg tgcacaccca ggcagagaat gctgagttca
181 tgaggaactt tcagaagggc caggtgaccc gagacggctt caagctggtg atggcctccc
241 tgtaccacat ctatgtggcc ctggaggagg agattgagcg caacaaggag agcccagtct
301 tcgcccctgt ctacttccca gaagagctgc accgcaaggc tgccctggag caggacctgg
361 ccttctggta cgggccccgc tggcaggagg tcatccccta cacaccagcc atgcagcgct
421 atgtgaagcg gctccacgag gtggggcgca cagagcccga gctgctggtg gcccacgcct
481 acacccgcta cctgggtgac ctgtctgggg gccaggtgct caaaaagatt gcccagaaag
541 ccctggacct gcccagctct ggcgagggcc tggccttctt caccttcccc aacattgcca
601 gtgccaccaa gttcaagcag ctctaccgct cccgcatgaa ctccctggag atgactcccg
661 cagtcaggca gagggtgata gaagaggcca agactgcgtt cctgctcaac atccagctct
721 ttgaggagtt gcaggagctg ctgacccatg acaccaagga ccagagcccc tcacgggcac
781 cagggcttcg ccagcgggcc agcaacaaag tgcaagattc tgcccccgtg gagactccca
841 gagggaagcc cccactcaac acccgctccc aggctccgct tctccgatgg gtccttacac
901 tcagctttct ggtggcgaca gttgctgtag ggctttatgc catgtgaatg caggcatgct
961 ggctcccagg gccatgaact ttgtccggtg gaaggccttc tttctagaga gggaattctc
1021 ttggctggct tccttaccgt gggcactgaa ggctttcagg gcctccagcc ctctcactgt
1081 gtccctctct ctggaaagga ggaaggagcc tatggcatct tccccaacga aaagcacatc
1141 caggcaatgg cctaaacttc agagggggcg aaggggtcag ccctgccctt cagcatcctc
1201 agttcctgca gcagagcctg gaagacaccc taatgtggca gctgtctcaa acctccaaaa
1261 gccctgagtt tcaagtatcc ttgttgacac ggccatgacc actttccccg tgggccatgg
1321 caatttttac acaaacctga aaagatgttg tgtcttgtgt ttttgtctta tttttgttgg
1381 agccactctg ttcctggctc agcctcaaat gcagtatttt tgttgtgttc tgttgttttt
1441 atagcagggt tggggtggtt tttgagccat gcgtgggtgg ggagggaggt gtttaacggc
1501 actgtggcct tggtctaact tttgtgtgaa ataataaaca acattgtctg从81-944序列得到的氨基酸与上面一致,共288个,与我查的一篇文献讲的heme oxygenase-1由288个氨基酸组成一致,不知这是不是我所需目的基因的cDNA序列呢?为了能和病毒载体相连,我要在上面的引物中加入BamH1和Hind111两个酶切位点.然后用此引物经RT-PCR是否可以从mRNA得到我所需的含目的基因(81-944)的片段呢?如果不行,那我的引物该如何设计呢?有人建议我从81和947两端开始设计引物,不知这两种方法哪一个好些?另外做分子克隆还有什么其它的需注意?请两位给我具体一点的建议.谢谢!
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Homo sapiens
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1441 atagcagggt tggggtggtt tttgagccat gcgtgggtgg ggagggaggt gtttaacggc
1501 actgtggcct tggtctaact tttgtgtgaa ataataaaca acattgtctg从81-944序列得到的氨基酸与上面一致,共288个,与我查的一篇文献讲的heme oxygenase-1由288个氨基酸组成一致,不知这是不是我所需目的基因的cDNA序列呢?为了能和病毒载体相连,我要在上面的引物中加入BamH1和Hind111两个酶切位点.然后用此引物经RT-PCR是否可以从mRNA得到我所需的含目的基因(81-944)的片段呢?如果不行,那我的引物该如何设计呢?有人建议我从81和947两端开始设计引物,不知这两种方法哪一个好些?另外做分子克隆还有什么其它的需注意?请两位给我具体一点的建议.谢谢!
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,请问你讲的"1，引物最好是跨越两个外显子区，至少有一条引物，这样可以防止基因组DNA污染，"这我不太明白.就我的这个基因,我要扩增含81-947这一段的片段,我该如何设计引物以满足上面的条件呢?谢谢指教!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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不好意思.发了两份,麻烦楼主清除一个.谢谢!我还有个问题.书上讲:在做RT-PCR时两引物要位于不同的外显子上,以防止基因组DNA污染.而用我上面提的方法找的1550bp的序列是不是全是外显子,还是只有81-944这一段里面的全是外显子,或只是部分是外显子?若只是部分是外显子应该如何找这一段?我是做克隆实验,要满足上面的条件,我的引物又该如何设计呢?请各位高人多多指教,万分感谢!并请求楼主给这些好心的高人们多加点分,再次感谢!
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引物要位于不同的外显子上主要目的是让引物中间有段内含子序列，这样DNA和RNA PCR出来的条带大小不一样。就可以很方便的消除基因组DNA的污染 。你根据这个原则去设计，应该问题不大的
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那我以mRNA为摸板,经RT-PCR来扩增得到cDNA.我的引物设计时也要让引物位于不同的外显子上吗?mRNA上还存在内含子吗?若有,我该如何区分那是外显子那是内含子呢?
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那我以mRNA为摸板,经RT-PCR来扩增得到cDNA.我的引物设计时也要让引物位于不同的外显子上吗?mRNA上还存在内含子吗?若有,我该如何区分那是外显子那是内含子呢?
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您做RT－PCR，不需要管内含子还是外显子，mRNA里已经没有这些东西了，如果是以基因组DNA为模板做PCR，才有可能设计到内含子、外显子。你一开始就讲的很清除是做RT-PCR，怎么又糊涂了？：）
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非常感谢笑佛及其他高人!!!此外,在我开始上面设计的引物上加入酶切位点后得到最终的引物序列,sense的5'端加BamH1酶切位点ggatcc,antisense5'端加Hind111酶切位点aagctt,而ata和 cgc为保护性碱基.
如下:sense:5-ata ggatcc agcacgaacgagcccagcac-3antisense:5-cgc aagctt ggtaaggaagccagccaagag-3用这对引物经RT-PCR从mRNA能得到我的目的基因吗?请各位帮我分析一下可行吗?是否还有更好的选择?我等着急用,谢谢!!!
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关于丁香园}