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【求助】新手做western blot，请教几个问题
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这个帖子发布于7年零195天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我昨天第一次做western blot，现在做到一抗孵育过夜，但今天发现昨天操作中有几个错误，想请教大家这几个问题对结果影响大吗，有没有补救措施。1、蛋白Marker也要煮沸吗？没煮沸会怎样？2、一抗稀释液一定要用封闭液稀释吗？我用的是TBST稀释，影响有多大？能不能现在再加入BSA后再孵育过夜，这样的补救措施，影响大吗？3、最初从玻璃板中取出的胶怎么定义左下角的？PVDF切角是在什么时候？在装转移夹时，我把凝胶切角放在左下角，而之后PVDF膜蛋白面切角在右下角，结果我应该怎么看？有没人总结了切角的方向的，我看着有些乱，是不是凝胶切左下角，装转移夹时放右下角，PVDF切右上角？还有人说凝胶切角和PVDF切角相对，怎么理解？4、是不是一定要先用丽春红染色？谢谢大家的帮忙！
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diaodiao2000 我昨天第一次做western blot，现在做到一抗孵育过夜，但今天发现昨天操作中有几个错误，想请教大家这几个问题对结果影响大吗，有没有补救措施。1、蛋白Marker也要煮沸吗？没煮沸会怎样？2、一抗稀释液一定要用封闭液稀释吗？我用的是TBST稀释，影响有多大？能不能现在再加入BSA后再孵育过夜，这样的补救措施，影响大吗？3、最初从玻璃板中取出的胶怎么定义左下角的？PVDF切角是在什么时候？在装转移夹时，我把凝胶切角放在左下角，而之后PVDF膜蛋白面切角在右下角，结果我应该怎么看？有没人总结了切角的方向的，我看着有些乱，是不是凝胶切左下角，装转移夹时放右下角，PVDF切右上角？还有人说凝胶切角和PVDF切角相对，怎么理解？4、是不是一定要先用丽春红染色？谢谢大家的帮忙！1. 不需要2. 没有影响3. 自己随便做个标记即可. 随便提前切个角就行.自己记得加样的顺序即可.4. 不需要
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谢谢！不过我昨天还是没曝出来，讨论了一下，可能和我用PVDF膜前没用纯甲醇泡有关系，我只用电转液泡了。
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diaodiao2000 谢谢！不过我昨天还是没曝出来，讨论了一下，可能和我用PVDF膜前没用纯甲醇泡有关系，我只用电转液泡了。建议好好复习一下western的工作原理PVDF膜是疏水性的.所以需要用methanol浸泡,再用transfer buffer去平衡, 不然水进不去good luck
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谢谢版主的建议。
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tk57ml 建议好好复习一下western的工作原理PVDF膜是疏水性的.所以需要用methanol浸泡,再用transfer buffer去平衡, 不然水进不去good luck看到热心的版主，真感动！实验之初，由错到对再到错，由难到易再到难，有人指导和关心是多么幸福啊！
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昨天做了第二次，内参曝出条带了，说明技术没问题了，但目的蛋白没曝出来，估计还是和细胞表达低有关，下次要加大上样量。
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diaodiao2000 昨天做了第二次，内参曝出条带了，说明技术没问题了，但目的蛋白没曝出来，估计还是和细胞表达低有关，下次要加大上样量。或者和抗体本身不好有关系
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一抗买的是abcam的，之前有人也用过这个抗体能曝出条带的，但她忘了加多少蛋白量了
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diaodiao2000 一抗买的是abcam的，之前有人也用过这个抗体能曝出条带的，但她忘了加多少蛋白量了建议先测一下蛋白浓度，然后决定上样体积
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测了蛋白浓度了，上样量已经达到30ug了。
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diaodiao2000 测了蛋白浓度了，上样量已经达到30ug了。BCA kit测的不准，以b-actin为准。可能是蛋白变形不够，你煮了多久？一般我95度5分钟。上25ug。
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Western Blot 小视频，熟手精进，新手改进！
作者：市场部
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新手做western blot，关于上样量。
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我是提取的肺组织，用BCA法测定蛋白浓度，每次上样量大家一般都是多少微克呢？根据微克算出来的微升，是直接在每个上样孔里加入算出来的微升呢，还是在每个上样孔里加入相同的体积呢？
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一、可以直接加上算出来的微升数。二、加上算出来的微升数，后用1成上样缓冲液补齐。三、为了上样简单些，可以调整浓度，统一上样量。本人采用过第一第二两种方法，感觉都可以，只是上样时要注意每只上样量不同，及时调整。
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我一般用30微克，如果条带不明显，可以上调。
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xuyang0515 我一般用30微克，如果条带不明显，可以上调。非常感谢，我在别人实验室看她们有些用的50微克，而我师姐用的40微克，这样算出来有一个蛋白有77微升，那个上样孔装不了那么多，我就在想这种怎么协调。
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77微升肯定上不了，是不是算错了？或者是蛋白提的有问题，我感觉你可能是算错了吧
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xuyang0515 77微升肯定上不了，是不是算错了？或者是蛋白提的有问题，我感觉你可能是算错了吧我师姐弄的，我也觉得肯定出问题了。
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那就是你蛋白液的浓度太低了，用冷冻干燥机处理一下，提高浓度后再上样，40ug蛋白就需要77ul，你这个提取液浓度确实堪忧。
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上样量不用像楼上说的那么多，20微克，甚至10微克完全OK的
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