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表达大肠杆菌分子伴侣GroEL、 GroES和GrpE载体的构建及其应用
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表达大肠杆菌分子伴侣GroEL、 GroES和GrpE载体的构建
官方公共微信以下试题来自：
问答题一个质粒携带有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。利用卡那霉素抗性基因内部的EcoR Ⅰ酶切位点进行人类生长激素基因的克隆。二者连接后转化对两种抗生素都敏感的大肠杆菌菌株。如何鉴别出哪些细菌获得了质粒哪些细菌含有的质粒上携带有人类生长激素基因 对氨苄青霉素有抗性的细菌；对氨苄青霉素有抗性、对卡那霉素无抗性的细菌。
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1.问答题 具有cos位点的质粒载体就是黏粒。由于它具有该位点可以被λ噬菌体的包装蛋白包装，从而具有克隆大片段外源DNA的能力。2.问答题 加抗生素Tet；抗Tet，对Kan敏感；把涂皿形成的菌落影印到新的含Kan的平皿中，凡是不能生长的克隆就是阳性克隆。3.问答题 简并引物PCR、合成寡核苷酸探针筛选基因组文库或cDNA文库、构建cDNA表达文库利用相应的抗体筛选。4.问答题 人工合成的一段含有限制性内切核酸酶识别位点的一小段DNA。连接到载体或外源DNA片段上，从而方便地制造出新的酶切位点，便于二者...... 5.问答题 前者不含内含子，后者有。前者仅是部分结构基因的克隆，后者包含了基因组的全部信息。
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最新相关试卷如何做原核表达-公司动态-上海士锋生物科技有限公司
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邮编：200431
联系人：王小姐
电话：021-传真：021-手机：
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如何做原核表达
们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质――胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆 做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。"在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体 ：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆 位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。复制子： 通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。筛选标记和报告基因： 氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉"已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半乳糖苷酶啊，荧光素酶啊等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。启动子、终止子和核糖体结合位点启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。组成型表达： 表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。融合表达 ：表达载体的多克隆 位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。分泌表达： 在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用――控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnBrRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意。表达菌株：我们往往最容易忽视的一点。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题，这一点生物通会有专门的介绍。同样的，交换获得的免费菌株，要小心其遗传背景是否已经发生改变？当心。注：以上各种特性是可以相互组合的，不是排他的！几个常用的启动子和诱导调控表达系统最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，由 启动子Plac+ 操纵基因lacO+结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。以λ噬菌体再起转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录，42度下解除抑制开发转录。同样的，PL、PR 表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有何高招？且看我为你一一道来：有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA 聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。二是采用带有T7lac启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA聚合酶的基因——T7融菌酶，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。
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Your Partner in Research & Development
植物基因编辑（CRISPR/Cas9） 技术服务
CRISPR 体系是存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统， 经过改造成
为一种高效的基因编辑工具， 可以在基因组水平上对 DNA 序列进行编辑。 原理
是 guide RNA 通过碱基互补配对识别靶位点并且引导核酸内切酶 Cas9 对靶位点
进行精确剪切， 随后细胞的自我修复机制造成了靶位点编辑， 即敲入或敲除。 目
前国内外研究人员已经运用 CRISPR/Cas9 系统实现了对人类细胞、 动物、 植物
和酵母等多个物种的基因编辑。
河南密码子公司以农杆菌介导的植物遗传转化体系为支撑， 构建了能同时表
达 Cas9 和多个 sgRNA 的双元载体， 适用于双子叶植物的基因敲除， 如拟南芥、
烟草、 番茄、 棉花、 西瓜等。
1、 未知功能基因的研究
通过 CRISPR/Cas9 技术敲除未知功能基因， 创造突变体材料， 观察突变体和
野生型的表型差异， 该技术为深入研究未知基因的功能提供了良好的方法和材
2、 已知功能基因的运用
利用 CRISPR 技术对已知功能基因进行敲除、 修饰， 使植株获得抗性或者更
优的性状， 此种技术可以为育种创制新材料， 也能够加快育种进程， 提供新品种。
Your Partner in Research & Development
1、 Crispr/Cas9 基因编辑技术相对于 ZFN 和 TALEN 简单易操作， 基因敲除效率
高且成本低。
2、 本公司有双子叶植物的 CRISPR/Cas9 载体和成熟的烟草遗传转化体系。
3、 针对客户的目的基因， 可一次设计 2 个 gRNA 靶点构建载体， 提高基因敲除
4、 本公司使用 ClonExpress&技术， 无须中间载体， 一步将目的片段和载体无缝
CRISPR-Cas9 技术的应用主要包括以下几个关键步骤（如图） ：
Your Partner in Research & Development
收费标准（元）
CRISPR/Cas9 载体（可选）
1 个靶点载体
提供质粒 1 ug， 含有载体使用说明书
2 个靶点载体
提供质粒 1 ug， 含有载体使用说明书
CRISPR/Cas9 载体构建
5 个工作日
1 个靶位点
提供质粒 2 - 4 ug
备注： 客户需提供 CRISPR 载体，
提供明确的靶位点序列
10 个工作日
2 个靶位点
提供质粒 2 - 4 ug
植物转化（可选）
烟草（T0 代植株）
20 株 Cas9 阳性植株
备注： 如需增加苗， 费用另计
靶基因测序（可选）
2-3 个工作日
提供 PCR 产物回收测序结果
Your Partner in Research & Development
1. 客户可以提供构建好的 CRISPR/Cas9 载体， 也可委托该公司构建； 公司提供
CRISPR-gRNA 载体构建服务， 您只需提供靶位点序列， 即可为您合成并克隆至
您指定的任何载体中。
2. 上述植物转化收费标准为该公司推荐的植物品种， 客户如指定转化品种， 双
方需另行协商， 并增加预实验。
3. 合同签订要先于项目启动， 项目会在确认收到客户寄送的生物材料后的 5 个
工作日内启动， 实验顺利开展后， 客户需支付预付款， 项目结束前的 15 日内需
支付剩余款项。
4. 客户可以筛选服务项目、 也可提出个性化要求， 双方协商确定技术方案和费
5. 每 1-2 个月向客户提交项目报告， 包含
1） 项目进展报告
2） 载体构建的电泳图片和和测序结果
3） 外植体侵染、 愈伤诱导、 胚性愈伤、 出芽生根情况、 植株再生等图片
4） T0 代植株 Cas9 基因 PCR 检测电泳图片
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目的基因 CRISPR 靶位点选择的网站
http://crispr./cgi-bin/CRISPR2/CRISPR
http://cas9.cbi./
http://www.rgenome.net/cas-offinder/
※ 靶位点区域选择：
获得目的基因的完整基因组序列和 CDS 信息， 找出基因的外显子序列和位
置， 确定靶点的大致位置。 一般情况下靶点应靠近翻译起始点， 均置于外显子区
域， 且选定区域 GC 含量最好在 40%~60%。
※ 靶位点的设计原则：
（1） 载体含有转录起始位点 G， 靶点序列长度 18~22bp， 一般设为 19bp；
（2） 靶点在基因组正负链上都可， 方向为 5&-3&， 在 3&末端必须有 NGG；
（3） 选择靶点时应包含 3&端 NGG， 构建载体引物时， 不应包含 3&端 NGG；
（4） 靶点序列相对特异， 避免在靶位点 3&端多联 T 碱基；
（5） 靶点序列应在基因组数据库中进行比对， 避免脱靶；
（6） 靶点 5&端 8-19 位的碱基不能有错配， 例如选取的靶位点为 N1-N19，
5&-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19-NGG-3&
N8-N19和目的基因匹配时不能有错配， N1-N7 可以允许有 1 个碱基的错配，
但整体靶位点能够匹配的序列不能少于 18bp。
CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体
CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体可以敲除双子叶植物基因的单位点和双位点：
Table1.CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体组分列表
Part NO.V50086
Part NO.V50027
------------
pUC57-T1T2
----------
pHSD4.1 可以用来直接构建一个靶位点的载体。
pHSD4.1 和 pUC57-T1T2 两个载体可以构建两个靶位点的载体， 操作简单。
购买我们的载体可免费提供一份详细的载体使用说明书。
※ 贮存条件
短期保存， 请在载体至于-20℃保存， 避免污染； 若长期保存， 请转化大肠杆
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菌， 并使用甘油菌保存。 pHSD4.1 为卡那霉素抗性， pUC57-T1T2 为氨苄抗性。
※ 载体图谱：
pUC57-T1T2
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载体构建的选择
※ 基因合成和亚克隆
您可以提供载体和基因序列， 并指定酶切位点， 我们根据您提供的信息合成
序列并亚克隆到您指定的任意载体上， 且多个载体构建可同时进行， 周期固定为
※ 优势： 省去 PCR 扩增、 载体酶切和连接、 测序的步骤， 也省去了试剂耗材费
用， 更能为您节省时间， 交付质粒冻干粉、 甘油菌和一份详细的检测报告， 您可
放心使用。
基因合成和亚克隆价格表
3.5-4.5 Kb
4.5-6.0 Kb
欢迎垂询！ 咨询电话： 5 咨询 QQ：
※ 自主完成载体构建
CRISPR 载体构建需要的试剂耗材
PE102-01 高纯度质粒小量提取试剂盒（离心柱型）
CC102-01 DH5&感受态细胞
PR112-01 KOD DNA Polymeras（with HighPure dNTP mix )
CV116-01 T4 DNA Ligase
PR121-01 2&Taq PCR MasterMix (with Dye)
CV106-01 一步法无缝克隆试剂盒（单片段克隆）
CV107-01 无缝克隆拼接试剂盒（单/多片段克隆）
BsaI 限制性内切酶
GV3101 感受态细胞
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遗传转化的步骤和试剂耗材
※ 烟草遗传转化的步骤主要有：
农杆菌侵染和共培养&诱导外植体出芽&诱导生根&成苗
※ 遗传转化必备的试剂耗材：
MS 培养基（sigma） 手术刀柄
6-BA 手术刀片
NAA 枪型镊
IBA 直径 12cm 玻璃培养皿
蔗糖 200mL 玻璃组培瓶
植物凝胶 Phytagel 2L 锥形瓶
潮霉素 B Roche 100mL 锥形瓶
硫酸卡那霉素 50mL 离心管
噻孢霉素 封口膜、 封瓶膜
组培中用的试剂如 MS 培养基、 植物激素和抗生素等， 都对外植体的生长和分化
有重要影响， 我公司为各位奋斗在一线的科研工作者提供 sigma 的原装正品， 能
保证试剂的品质和质量， 让您少走弯路， 为您节省时间。
Cas9 阳性苗的检测
阳性苗的检测使用公司自主研发的直扩试剂盒， 只需要取少量植物组织（芝麻粒
大小） 就可直接检测是否存在目的基因。
DT103-01 植物 PCR 直接扩增试剂盒
1、 省去了提 DNA 的繁琐步骤和时间
2、 不伤害转基因苗， 不影响苗的正常生长
3、 结果准确可靠， 直接用新鲜组织提取， 不会因为 DNA 的降解而影响实验。
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中国生物器材网 电话：021-下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌 的示意图.图a是基因工程中经常选用的载体-pBR322质粒.Ampr表示氨苄青霉素抗性基因.Tetr表示四环素抗性基因．目的基因如果插入某抗性基因中.将使该基因失活.而不再具有相应的抗性．为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌.将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的 题目和参考答案——精英家教网——
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& 题目详情
下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。图a是基因工程中经常选用的载体-pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因．目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性．为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）．再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）．据此分析并回答：（1）pBR322质粒的基本组成单位是&&&&&&&&。在基因工程中，质粒上的Amrr、Tetr称为&&&&&&基因。（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&，由此说明&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（3）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的&&&&&&&&&&&&&步骤，该基因工程中的受体细胞是&&&&&&&&。
（1）脱氧核苷酸 &&&标记（2）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素&&&&&目的基因插入了Tetr中（3）筛选含目的基因的受体细胞&&&&&&大肠杆菌
解析试题分析：（1）pBR322质粒的基本组成单位是脱氧核苷酸。在基因工程中，质粒上的Amrr、Tetr称为标记基因。（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素，由此说明目的基因插入了Tetr中。（3）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的筛选含目的基因的受体细胞步骤，该基因工程中的受体细胞是大肠杆菌。考点：本题考查基因工程，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系。
科目：高中生物
题型：综合题
下图甲为某反射弧结构示意图(“-●--&”表示从树突到细胞体，再到轴突及其末梢)，图乙表示神经纤维局部放大后膜内外电荷的分布情况。甲　　　　　　　　　　　　　　　乙（1）图甲中一共有________个神经元。（2）若图甲中①～⑤分别表示反射弧的五个组成部分，则①表示_________。兴奋在②处以______信号形式传导，在d处转变成________信号形式传递。（3）如甲图所示，在④处和②处细胞膜外表面分别安放一个灵敏电流计G1和G2，然后电刺激图中所示②处一点，产生的兴奋在②处可以向_______(左、右、左和右)传导，G1和G2的指针偏转情况分别是______、______。A．不发生偏转 B．发生一次偏转C．发生2次方向相同的偏转 D．发生2次方向不同的偏转（4）图乙中表示兴奋部位的是__________。
科目：高中生物
题型：综合题
Ⅰ某兴趣小组成员为了探究酵母菌在呼吸作用过程中气体体积的变化（已知相同条件下，分子数相同的任何气体，体积相同），进行了实验．在装有酵母菌和足量葡萄糖溶液的气球中通入O2和CO2直到饱和，再注入一定量的氧气，扎紧后放入装有温水的量筒中（如图所示），记下液面的读数，以后每隔一段时间进行观察并记录量筒中液面的读数．请回答下列问题：（1）从呼吸方式上，酵母菌是 &&&&&&&&&&型；其细胞结构与下列哪种生物有明显的区别？ &&&&&&&&&&&A．水稻 B．蘑菇 C．西瓜 D．大肠杆菌 （2）若不考虑温度变化对气体体积的影响，则实验过程中量筒内的液面如何变化 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&？ （3）若将装置中的温水换成冷水，重复以上实验，则量筒内液面变化的速率将 &&&&&&&&（选填“加快”、“不变”或“减慢”）。Ⅱ在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用显微计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由25×16=400个小格组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将l mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的3处错误：①&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&；②&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&；③&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行&&&&&&&&&处理。(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是&&&&&&&&&&&&&。(4)如果观察到上图所示a、b、c、d、e 5个中格共80个小格内共有酵母菌48个，则上述1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释后有酵母菌&&&&&&&&&&&个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做?
科目：高中生物
题型：综合题
请回答关于群落演替的问题：（1）在光裸的岩石上开始的演替和从森林被全部砍伐的地方开始的演替中，哪个属于初生演替，哪个属于次生演替？（2）一般来说，若要演替到相对稳定的森林阶段，上述两个演替中次生演替所需的时间短，分析其主要原因。（3）据调查，近5万年以来，某地区由于气候越来越干燥，森林逐渐被灌丛取代，这也是自然界存在的一种演替类型。近50年来，由于人类过度开垦，导致局部灌丛出现了荒漠化，该现象表明：与该地区具有的自然演替相比，人类的开垦活动使得该地区群落的演替速度&&&&&&&&（填“未发生改变”、“变慢”或“变快”），演替的方向&&&&&&&&&&&&&&&（填“发生改变”或“未发生改变”）
科目：高中生物
题型：综合题
每年的7月11日被定为“世界人口日”,人口问题越来越受到国际社会的重视。下图表示三种可能的人口增长曲线,请回答下列问题。(1)16世纪以来,世界人口增长表现为图中a曲线,人口剧增带来的严重后果有&&&&。如果这种现状不能得到有效改善,人口增长趋势终将表现为图中曲线&&&&。(2)按生态学原理,世界人口增长应该表现为图中&&&曲线,该曲线与a曲线产生差别的原因是&&&&&&。若地球环境对人类种群的容纳量(K)为110亿,则全球人口的最适数量为&&&。(3)为缓解人口增长带来的世界性粮食紧张状况,人类可以适当改变膳食结构。若将(草食)动物性与植物性食物的比例由1∶1调整为1∶4,地球可供养的人口数量是原来的&&倍。(能量传递效率按10%计算,结果精确到小数点后两位数字)(4)我国现阶段实行计划生育政策,提倡晚婚晚育,一对夫妇只生一个孩子。这一政策能有效地控制人口增长过快的趋势,原因是&&&&&&&&&&&&&。
科目：高中生物
题型：综合题
DMS（二甲基硫醚）是一种对气候有明显影响的气体。下图是DMS在海洋中生成的主要过程，分析回答：（1）从生态系统的组成成分上看，圆石藻属于&&&&&&&&&&&&。圆石藻、浮游动物、海洋细菌等生物共同构成&&&&&&&&&&&&。科学家正通过研究圆石藻残骸在海底沉积物中的分布特征探索海洋气候变化的线索，这体现了生物多样性的&&&&&&&&&&&价值。（2）图中浮游动物所同化的能量除经自身呼吸作用以热能形式散失外，还将流向&&&&&&__________________________________。中间产物X浓度上升到一定程度时，它能作为一种化学信息使浮游动物对圆石藻的捕食明显减少。这体现了生态系统中信息传递的作用是&&&&&&&&&&&&&&&&&。（3）海洋中存在含酶A量较多和较少的两类圆石藻。由图中信息推断，浮游动物偏好摄食哪类圆石藻？&&&&&&&&&&&&&&。当圆石藻大量繁殖会诱发病毒侵染其细胞，从而使其数量下降，这体现了生态系统可通过&&&&&&&&&&&调节机制维持自身的相对稳定。（4）研究发现，海洋中许多生物能促进DMS氧化分解，最终产生SO42-，从而加快了生态系统的_______________。
科目：高中生物
题型：综合题
嗜热土壤芽胞杆菌产生的β—葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶⑴PCR扩增bglB基因时，选用&&&&&&&&&&&&&&&&&基因组DNA作模板。⑵下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入&&&&&&&&&和&&&&&&&&&&&&&&不同限制酶的识别序列。⑶大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。Ⅱ．温度对BglB酶活性的影响⑷据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会&&&&&&&&&&；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在&&&&&&&&&（单选）。A．50℃&& B．60℃&& C．70℃& D．80℃Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率，经过筛选，可获得能表达热稳定性高的BglB酶的基因。⑸与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中&&&&&&&&（多选）A．仅针对bglB基因进行诱变B．bglB基因产生了定向突变C．bglB基因可快速积累突变D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
科目：高中生物
题型：综合题
细胞作为最基本的生命系统，其形态、结构、功能保持相对稳定。生命系统通过各个层次的信息和反馈调节等活动维持其自身稳定，执行其正常功能。图1为高等动物细胞亚显微结构模式图，图2表示细胞间通讯中信号分子对靶细胞作用的一种方式。（1）从化学成分角度分析，流感病毒与图1中结构&&&&&&&&&（填序号）的化学组成最相似。（2）图2中①为信号分子，结构②的组成成分是&&&&&&&&&&&。（3）在图1中，能发生碱基互补配对现象的细胞器有&&&&&&&&&（填序号）。（4）具有图1细胞的生物，在生态系统的结构中一般不可能是&&&&&&&&&&成分。（5）若该动物细胞可产生生长激素，则此细胞为&&&&&&&&&细胞，生长激素合成与分泌过程中依次经过的细胞结构有&&&&&&&&&&&&&&&&（填序号）。（6）研究推测，水分子的跨膜运输不是真正的自由扩散，它最可能与膜上的蛋白质有关。科学家试图从肾小管壁细胞膜上寻找这种蛋白质，以这种细胞为实验材料的最可能依据是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
科目：高中生物
题型：综合题
图A是某植物细胞的亚显微结构模式图，图B为某动物细胞分泌蛋白合成和分泌的途径，请据图回答问题：&（1）图B细胞中分泌蛋白的释放与其他细胞产生的信号有关，说明细胞膜具有_____________功能。（2）A图细胞中与能量转换有关的细胞器是____________(填标号)。某种毒素能抑制细胞有氧呼吸，该毒素可能损伤了______________(填细胞器名称)。（3）若将A图细胞置于0．3g/mL的蔗糖溶液中将会出现细胞壁与____________发生分离；（4）假如A图为动物细胞，应添加的结构是________(填细胞结构名称)。（5）若用含18O标记的氨基酸培养液培养B图细胞，发现在合成分泌蛋白的过程中产生了H218O，则H218O的生成部位是_________(填细胞结构名称)，该细胞中出现放射性18O的部位依次为________(填图中标号)。（6）B细胞在分泌物分泌前后几种生物膜面积将会发生改变，由此可以说明，生物膜的结构特点是___________________。
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