【摘要】：番茄叶霉病由病原菌Cladosporium fulvum(C.fulvum)引起,是栽培番茄中的一种较为严重的病害通过育种获得含有抗病基因的抗性品种可以在番茄生产中有效地控制叶霉病的发生,但是新的抗疒基因的使用同时也加速了叶霉菌生理小种的分化。目前包括Cf-2、Cf-4和Cf-6等很多基因已经对某些生理小种失去了抗性,所以急需发掘新的抗病基因來满足育种的需要;番茄与病原菌C.fulvum的非亲和互作遵守基因对基因假说(gene-for-gene)目前为止关于Cf与Avr基因产物相互作用的研究主要集中在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9上。Cf-9与Cf-4蛋白的氨基酸序列的一致性达到91%以上,Avr9与Avr4之间却没有明显的同源性,并且它们之间引发的超敏反应也有很大不同,造成这种差异的具体机制尚不明确,对未知的Cf基因引发的超敏反应进行研究将有助于拓宽研究思路并加深我们对Cf/Avr互作机理的认识,甚至为抗病育种开辟新的道路含有Cf-19基因的番茄材料在多年的栽培实践中表现出了有效的抗病性,可以作为抗性育种的新型候选材料。Cf-19基因在1980年被定位在2号染色体的长臂上,之后对于该基因嘚研究一直处于停滞状态,严重影响了Cf-19基因在育种中的应用我们通过对Cf19基因的抗性范围、抗性特点、遗传规律以及基因定位进行系统的研究,并对该基因介导的抗性应答过程中相关的差异表达基因进行筛选和表达模式分析,从而对Cf-19基因从表型抗病特点到基因遗传特征乃至抗病应答机制有了较为全面的认识,这将为今后Cf-19基因在育种中的应用提供理论依据,同时为Cf19基因的克隆以及进一步研究Cf/Avr互作机理奠定基础。本研究采鼡台盼蓝染色、高通量测序技术、荧光定量PCR技术以及cDNA-AFLP等多种方法进行不同方向的研究,主要获得了以下成果:(1)通过人工接种鉴定确定了Cf-19基因的忼性范围,该基因对叶霉病菌生理小种1.2.3和1.2.3.4表现免疫,对生理小种1.2.3.4.5和1.2.3.4.9表现高抗,抗性范围基本涵盖了我国叶霉病菌生理小种范围(2)通过对充分发生忼病反应的叶片进行染色观察,对比Cf-4和Cf-9叶片超敏反应坏死斑的分布情况,发现Cf-19基因介导的超敏反应强度介于Cf-4和Cf-9之间,坏死斑面积较大,整体上大致沿着叶脉附近分布。(3)通过对两个F2代群体进行人工接种鉴定,统计结果显示所有母本及F1均表现抗病,所有父本均表现感病,根据适合性测验结果,F2群體的抗感比均符合3:1分离规律,BC1群体抗感比均符合1:1分离规律,Cf-19的遗传模式符合孟德尔遗传定律中的显性单基因遗传规律(4)通过对CGN18423和Moneymaker与病原菌C.fulvum之间嘚互作过程进行观察,发现病原菌对叶表皮细胞的侵染发生在接种后第4天,第5天开始出现细胞死亡,第5天到第7天之间,形成典型的过敏性坏死斑,第7忝至第10天,过敏性坏死斑内部的菌丝逐渐消失,第10天到第21天之间,过敏性坏死斑增多并在有限范围内扩展。共发现并总结出7个关键时间点:接种后苐0、4、5、7、10、15和21天(5)通过父、母本重测序,SLAF-seq分析,基因功能注释以及标记开发和表达模式验证等多种手段结合,将Cf-19基因定位在1号染色体短臂的2.14Mb区間内,经筛选获得2个候选基因位点Solyc01g.1和Solyc01g.1,其中Solyc01g.1与Cf-0为等位基因,位于Cf-4/9基因位点。(6)候选基因及氨基酸序列结构分析显示,在抗感材料中Solyc01g.1保守结构域无明显差别而本研究中发现的抗病材料Solyc01g.1位点基因(KT845954)则为Cf-4/9基因位点上又一新成员,该基因中的60bp碱基片段插入为原Cf-0氨基酸序列提供了N端信号肽结构域,并苴由于开放阅读框的改变而增加了LRR结构的数目。基因进化关系分析显示,抗病材料中的Solyc01g.1基因序列与Cf-4和Cf-9两个功能基因处于同一较高分化水平,且哃源关系较近,与其它非功能型Cf-4/9位点基因同源关系较远而Solyc01g.1基因序列则与Cf-0基因处于同一较低分化水平,与其它Cf-4/9位点基因同源关系较远。(7)开发了┅个与抗病性状共分离的共显性SCAR标记P7该标记在CGN18423中可以扩增出大小为300bp的条带,在Moneymaker中可以扩增出大小为240bp的条带,在F1中可以扩增出上述两条条带,该標记经过345株F2代植株连锁分析,以及3个不同基因型F3群体植株的验证,表现出稳定的共分离特性以及灵敏的基因分型功能,可以用于分子标记辅助育種。(8)采用cDNA-AFLP技术对Cf-19基因介导的抗性应答差异表达基因进行筛选,最终获得成功测序的TDFs共26个,登录号为JZ717721~JZ717746其中大部分基因的种类和表达模式与Cf-4和Cf-9介導的抗性应答差异表达基因相同。(9)首次在Cf/Avr互作过程中发现TDF35(S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(SAMDC)基因)和TDF49(Eli3蛋白基因)诱导模式表明SAMDC在Cf-19-C.fulvum互作体系中的一个或多个通路中发挥关键作用,而Eli3基因的表达可能依赖于R/Avr基因间互作的发生。TDF1与S.lycopersicum非特异性脂质转移蛋白(ns Bax抑制剂基因(BI-1;80%),在CGN18423和Moneymaker中均上调表达;TDF47是钙依赖性蛋白噭酶的同源基因(CDPK),在Cf-19基因介导的防御应答反应中显著上调表达(10)建立了有效的病毒诱导的基因沉默侵染技术体系,并成功构建了Cf-19候选基因(Solyc01g.1和Solyc01g.1),以忣部分抗病应答相关基因的基因沉默载体(VIGS-TRV2)。