Hepatitis B Synthetic Immunogen Comprised of Nucleocapsid T-Cell Sites and an Envelope B-Cell Epitope on JSTOR
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Hepatitis B Syntheti...
Journal Article
David R. Milich, Janice L. Hughes, Alan McLachlan, George B. Thornton and Ann Moriarty
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Vol. 85, No. 5 (Mar. 1, 1988), pp.
Published by:
Stable URL: http://www.jstor.org/stable/31280
Page Count: 5
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B lymphocytes
Immunization
B lymphocyte epitopes
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Previous studies located T-cell recognition of the nucleocapsid of the hepatitis B virus (HBcAg) to residues 120-140 in mice bearing the H-2s or H-2b haplotypes. Herein, we demonstrate that B10.S (H-2s) and B10 (H-2b) H-2 congenic strains recognize distinct T-cell sites within the p120-140 (a synthetic peptide corresponding to residues 120-140 of HB-cAg) sequence defined by p120-131 and p129-140, respectively. Peptide p120-131 stimulates B10.S HBcAg-primed T cells, and reciprocally p120-131-primed T cells recognize HBcAg. Similarly, the p129-140 sequence is a T-cell recognition site relevant to the native HBcAg in the B10 strain. It is also shown that these 12-residue peptides efficiently prime T-helper cells, which are capable of eliciting antibody production to HBcAg in vivo. These observations prompted us to examine the ability of the HBcAg-specific p120-140 sequence to function as a T-cell carrier moiety as a component of a totally synthetic hepatitis B vaccine. For this purpose a synthetic B-cell epitope from the pre-S(2) region (p133-140) of the viral envelope was chosen because this sequence represents a dominant antibody-binding site of the envelope. Immunization of B10.S and B10 strains with the synthetic composite peptide c120-140-(133-140) elicited anti-peptide antibody production, which was crossreactive with the native viral envelope. Furthermore, c120-140-(133-140) immunization primed p120-131-specific T cells in the B10.S strain and p129-140-specific T cells in the B10 strain, which recognized HBcAg and provided T-helper cell function for anti-envelope antibody production in vivo. These results demonstrate the feasibility of constructing complex synthetic immunogens that represent multiple proteins of a pathogen and are capable of engaging both T and B cells relevant to the native antigens.
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German Patent DE
zur Herstellung von Nitrilen der Formel (II)R - C ≡ Ndurch
Umsetzung vonN-Alkylcarbons?ureamiden
(RCO-NHR1) oder Ammoniumsalzen von Carbons?uren (RCOO-NH3R1+) oder Carbons?uren in
Gegenwart von Alkylaminen bzw. Ammoniumsalzen (RCOOH + NH2R1, RCOOH + NH3R1+),wobei
R für einen
beliebig substituierten linearen oder verzweigten C1-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder einen
Aryl- oder Heteroarylrest und R1 für einen
beliebigen substituierten, linearen oder verzweigten C2-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinylrest steht,mit
Phosphons?ureanhydriden
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base in einem organischen L?sungsmittel
bei einer Temperatur im Bereich von -30 bis 180°C.Als Phosphons?ureanhydrid
wird insbesondere ein 2,4,6-substituiertes 1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid
der Formel (I) eingesetzt.
Inventors:
Meudt, Andreas, Dr. (Hofheim, 65719, DE)
Nerdinger, Sven, Dr. (Unterhaching, 82008, DE)
B?hm, Claudius, Dr. (Frankfurt, 60594, DE)
Application Number:
Publication Date:
02/01/2007
Filing Date:
07/25/2005
Export Citation:
Archimica GmbH (Frankfurt, 65929, DE)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
Zounek, Plate, Schweitzer Patentanwaltskanzlei (Wiesbaden, 65203)
1. Verfahren zur Herstellung von Nitrilen der Formel
(II) R-C≡N(II)durch Umsetzung
von o N-Alkylcarbons?ureamiden
(RCO-NHR1) oder o Ammoniumsalzen von Carbons?uren (RCOO-NH3R1+) oder o Carbons?uren in
Gegenwart von Alkylaminen oder Ammoniumsalzen (RCOOH + NH2R1, RCOOH + NH3R1+) wobei
R für einen
beliebig substituierten linearen oder verzweigten C1-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder einen
Aryl- oder Heteroarylrest und R1 für einen
beliebigen substituierten, linearen oder verzweigten C2-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinylrest steht, mit
Phosphons?ureanhydriden
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base in einem organischen L?sungsmittel
bei einer Temperatur im Bereich von –30 bis 180°C,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das Phosphons?ureanhydrid
ein 2,4,6-substituiertes 1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid der Formel
(I) ist, R' unabh?ngig voneinander für offenkettige
oder verzweigte, ges?ttigte
oder unges?ttigte,
geradkettige C1 bis C16-Alkylreste
oder cyclische C3 bis C16-Alkylreste
Aryl oder Heteroaryl steht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass R' für einen
Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 2-Butyl, Isobutyl,
Pentyl, Hexyl, insbesondere einen Ethyl-, Propyl- und/oder Butyl-Rest
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass das Phosphons?ureanhydrid
Propanphosphons?ureanhydrid
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Phosphons?ureanhydrid entweder als Schmelze
oder gel?st
in einem L?sungsmittel
der Amid- oder Formamid- enthaltenden Reaktionsl?sung zugegeben wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
dass das Phosphons?ureanhydrid
in einem aprotischen L?sungsmittel,
vorzugsweise in einem Verh?ltnis
von 1:1 bis 2:1, bezogen auf die Carbons?ure zugegeben wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass als Base ein terti?res Amin der Reaktionsmischung
zugesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
dass Triethylamin, Tripropylamin, Benzyldimethylamin, N,N-Dimethylanilin
oder Pyridin als Base zugesetzt wird.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Base in einem Verh?ltnis von
1 bis 2 ?quivalenten,
vorzugsweise 1 bis 1,2 ?quivalenten,
bezogen auf die Carbons?ure
zugegeben wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsl?sung nach Zugabe des Phosphons?ureanhydrids
auf die Reaktionstemperatur erhitzt wird.
Description:
sind bedeutsame und ?usserst vielseitig
verwendbare Zwischenprodukte in der organischen Synthese. Beide
Verbindungsklassen zeigen eine hohe Reaktivit?t der C,N-Mehrfachbindung,
wodurch zahllose Heterocarbonyl-Reaktionen erm?glicht werden. Die Bedeutung
in der modernen organischen Synthese wird nur durch Limitierungen
der Zug?nglichkeit
dieser Verbindungsklassen eingeschr?nkt. Standardverfahren zur
Herstellung von Nitrilen sind Dehydratisierungen von Carbons?ureamiden,
wobei zahllose Reagenzien wie beispielsweise POCl3 eingesetzt werden
der modernen organischen Synthese nimmt die Bedeutung chemo-, regio-
und stereoselektiver Reagenzien explosionsartig zu. Will man beispielsweise
in einem komplexen Molekül
mit zahlreichen, teilweise nur geringe Reaktivit?tsunterschiede aufweisenden
funktionellen Gruppen eine bestimmte S?uregruppe in ein Amid überführen, ohne
dabei andere Gruppen zu beeinflussen (z.B. Epimerisierung chiraler
Funktionalit?ten),
unselektive Methoden wie SOCl2 keine Anwendung mehr finden. Ein hochselektives
Reagenz zur ?usserst selektiven Amidbindungsknüpfung, das
selbst in Oligopeptiden ausgezeichnete Selektivit?ten und
Ausbeuten ohne Epimerisierung erbringt, ist Propanphosphons?ureanhydrid
Dieses Reagenz ist in verschiedenen L?sungsmitteln kommerziell erh?ltlich und
bequem einsetzbar. Die Performance dieses Reagenzes ist so hoch,
dass das Problem der Knüpfung
von Amid- und Peptidbindungen
in komplexen Molekülen heute
als gel?st
betrachtet werden kann.Eine
vergleichbare Probleml?sung
für die ?berführung von
Carbons?uren
und N-Alkylcarbons?ureamide
in die entsprechenden Nitrile fehlte bisher. Die bekannten Reagenzien
zwar die gewünschten
Transformationen bewerkstelligen, dabei werden aber oft andere Gruppierungen
ebenfalls beeinflusst. In vielen F?llen werden durch die drastischen
erforderlichen Bedingungen selbst entfernt stehende Stereozentren
epimerisiert.Es
w?re daher
sehr wünschenswert,
ein Verfahren zu haben, das Carbons?uren und N-Alkylcarbons?ureamide
durch Dehydratisierung in die entsprechenden Nitrile überführen kann,
dabei aber gleichzeitig sehr hohe Chemoselektivit?ten aufweist, und
zus?tzlich
in wirtschaftlich nutzbaren Verfahren einsetzbar ist. Die bekannten
Reagenzien l?sen
dieses Problem nicht, wie an einigen Beispielen demonstriert werden
soll: POCl3 in Kombination mit Basen kann die genannten Reaktionen
zwar bewerkstelligen, allerdings reagiert fast jede m?gliche funktionelle
Gruppe ebenfalls mit diesem Reagenz. Mit Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) kann man ebenfalls die gewünschte
Transformation in Nitrile durchführen,
allerdings treten hierbei h?ufig
partielle E schlimmer noch sind h?ufig aber
die Eigenschaften des als Folgeprodukt gebildeten Dicyclohexylharnstoffs,
der oft kaum oder nur durch chromatographische Trennungen vom Produkt
getrennt werden kann. Die Verwendung von wasserl?slichen DCC-Derivaten ist meist
durch deren sehr hohen Preis und schwierige Zug?nglichkeit nicht wirtschaftlich
durchführbar.?berraschenderweise
wurde gefunden, dass Alkylphosphons?ureanhydride alle diese Probleme l?sen und
ideale und hochselektive Reagenzien zur ?berführung von Carbons?uren und
N-Alkylcarbons?ureamide
durch Dehydratisierung in die entsprechenden Nitrile sind, wobei
gleichzeitig die gewünschte
Epimerisierungsfreiheit und maximale Regio- und Stereoselektivit?t beobachtet
vorliegende Erfindung betrifft somit ein hochselektives Verfahren
zur Herstellung von Nitrilen der Formel (II), R-C≡N(II)durch Umsetzung
von o N-Alkylcarbons?ureamiden
(RCO-NHR1) odero Ammoniumsalzen
von Carbons?uren (RCOO-NH3R1+) odero Carbons?uren in
Gegenwart von Alkylaminen oder Ammoniumsalzen (RCOOH + NH2R1, RCOOH + NH3R1+) wobei
R für einen
beliebig substituierten linearen oder verzweigten C1-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder einen
Aryl- oder Heteroarylrest und R1 für einen
beliebigen substituierten, linearen oder verzweigten C2-C12-Alkylrest, einen C3-C12-Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinylrest steht, mit Phosphons?ureanhydriden
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base in einem organischen L?sungsmittel
bei einer Temperatur im Bereich von –30 bis 180°C.In
einer bevorzugten erfindungsgem?ssen Ausführungsform
ist das Phosphons?ureanhydrid
ein 2,4,6-substituiertes 1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid der Formel
(I), und R' unabh?ngig voneinander für offenkettige
oder verzweigte, ges?ttigte
oder unges?ttigte,
geradkettige C1 bis C16-Alkylreste,
insbesondere einen C2 bis C12-Alkylrest, oder cyclische
C3 bis C16-Alkylreste oder
oder Heteroaryl steht. Besonders bevorzugt werden Phosphons?ureanhydride
der Formel (I), in denen R' für einen
Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 2-Butyl, Isobutyl,
Pentyl, Hexyl, insbesondere einen Ethyl-, Propyl- und/oder Butyl-Rest steht,
ganz besonders bevorzugt Propanphosphons?ureanhydrid (T3P).Die
Dehydratisierung zu Nitrilen (II) wird dabei im allgemeinen bei
Temperaturen im Bereich von –30
bis +180°C
durchgeführt,
bevorzugt sind Temperaturen im Bereich von 0 bis 120°C, insbesondere +30
bis +70°C,
wobei tiefere Temperaturen im allgemeinen mit h?heren Selektivit?ten korreliert
sind. Die Reaktionsdauer ist abh?ngig
von der angewandten Temperatur und betr?gt im allgemeinen 1 bis 12 Stunden,
insbesondere 3 bis 6 Stunden.Das
Phosphons?ureanhydrid
kann dem Reaktionsmedium entweder als Schmelze oder als flüssige Mischung
in einem L?sungsmittel
zugegeben werden.Geeignete
L?sungsmittel
sind dabei solche, die keine Nebenreaktionen mit dem Phosphons?ureanhydrid
ergeben, dies sind alle aprotischen organischen L?sungsmittel,
wie z.B. Ligroin, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Cyclopentan,
Cyclohexan, Cycloheptan, Cyclooctan, Dichlormethan, Chloroform,
Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichlorethan, 1,1,2,2-Tetrachlorethan,
Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Dimethylformamid,
Diethylformamid, Dimethylacetamid, Diethylacetamid, Diethylether,
Diisopropylether, tert-Butyl-Methylether, THF,
Dioxan, Acetonitril oder Gemische aus diesen, besonders bevorzugt
sind Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat,
Dimethylformamid, Diethylformamid, Dimethylacetamid, Diethylacetamid,
Diisopropylether, tert-Butyl-Methylether, THF, Dioxan, Acetonitril
oder Gemische aus diesen, ganz besonders bevorzugt werden Dichlormethan,
Chloroform, Ethylacetat, Butylacetat, Dimethylformamid, Dimethylacetamid,,
tert-Butyl-Methylether, THF, Dioxan, Acetonitril oder Gemische aus
diesen, insbesondere bevorzugt sind THF, Ethylacetat oder Butylacetat.Die
Zugabe des Phosphons?ureanhydrids erfolgt
mindestens st?chiometrisch
in Bezug auf die Ausgangsverbindung (Carbons?ure), kann aber auch überst?chiometrisch
sein, beispielsweise im Verh?ltnis
Umsetzungen werden bevorzugt so durchgeführt, dass das entsprechende
N-Alkylamid in einem L?sungsmittel
vorgelegt wird, dann auf die Reaktionstemperatur erw?rmt und
anschliessend durch
Zudosieren des Phosphons?ureanhydrids
als Schmelze oder L?sung
in einem der vorstehend genannten L?sungsmittel dieses in das gewünschte Nitril überführt wird.Die
Isolierung des Reaktionsproduktes erfolgt bevorzugt durch Hydrolyse
und einfache Phasentrennung, da die Folgeprodukte der Phosphons?ureanhydride
allgemein sehr gut wasserl?slich
sind. Je nach Natur des zu isolierenden Produkts k?nnen dabei
auch Nachextraktionen erforderlich sein. Das gebildete Phosphons?ureanhydrid-Folgeprodukt st?rt Folgereaktionen
oft nicht, so dass auch der direkte Einsatz der erhaltenen Reaktionsl?sungen oft
sehr gute Ergebnisse bringt.Ein
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird ein Ammoniumsalz einer Carbons?ure (RCOO-NH3R1+) durch einfaches Erw?rmen mit dem Phosphons?ureanhydrid
analog dem oben beschriebenen Verfahren in ein Nitril überführt. Hieraus ergibt
sich auch ein sehr elegantes und ebenfalls ?usserst selektives Verfahren
zur direkten ?berführung von
Carbons?uren
in Nitrile dergestalt, dass man ein beliebiges Ammoniumsalz zur
Carbons?ure
gibt und anschliessend
in Gegenwart einer Base mit einem Phosphons?ureanhydrid umsetzt.Geeignete
Basen sind beispielsweise terti?re
Amine wie Triethylamin, Tripropylamin, Benzyldimethylamin, N,N-Dimethylanilin
oder Pyridin.Die
Base wird üblicherweise
in einem Verh?ltnis
von 1 bis 5 ?quivalenten,
vorzugsweise 1 bis 3, insbesondere 1 bis 2 ?quivalenten, bezogen auf die
Carbons?ure
zugegeben.Das
Verfahren kann auch so durchgeführt werden,
dass eine L?sung
oder Suspension der umzuwandelnden Carbons?ure in Kohlenwasserstoffen oder
Estern wie Ethyl- oder Butylacetat mit mindestens einem ?quivalent
N-Alkylamin versetzt und nachfolgend mit dem Phosphons?ureanhydrid
behandelt wird.Alle
benannten Verfahrensweisen zeichnen sich durch sehr gute Ausbeuten
(typisch 90-100 %, insbesondere & 95
%) und einfache Aufarbeitung bei gleichzeitiger Abwesenheit von
Nebenreaktionen sowie von Epimerisierungen aus. Die Selektivit?ten und die
Produktreinheiten der erfindungsgem?ssen Reaktion liegen im Bereich
von 97-100 %, insbesondere 99-100
erfindungsgem?sse Verfahren
soll durch die nachfolgenden Beispiele erl?utert werden, ohne die Erfindung
darauf zu beschr?nken: Beispiel 1: Benzonitril
aus Benzoes?ure1
mol Benzoes?ure,
1,1 mol tert-Butylamin und 2 mol NEt3 werden
in 150 mL Ethylacetat vorgelegt. 1,2 mol T3P-L?sung in Ethylacetat (50 % w/w) werden
im Laufe einer Stunde zudosiert, anschliessend wird weitere drei Stunden
bei dieser Temperatur nachgerührt.
Zu dieser Zeit zeigte das Reaktions-GC einen Umsatz von 100 % an.
Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden zum Sieden erhitzt und nach
auf Raumtemperatur wurden 180 mL Wasser zugeben und die Phasen getrennt.
Die organische Phase wurde destilliert. Die isolierte Ausbeute dieser
Reaktion betrug 96 %, HPLC-Reinheit 98 % (a/a).Beispiel 2: 4-Methoxybenzonitril
aus 4-Methoxybenzoes?ure-tert.-octylamid1
mol 4-Methoxybenzoes?ure-tert.-octylamid,
und 2 mol NEt3 werden in 150 mL Ethylacetat vorgelegt.
1,2 mol T3P-L?sung
in Ethylacetat (50 % w/w) werden zudosiert. Die Reaktionsmischung
wird 3 Stunden zum Sieden erhitzt und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden
180-mL Wasser zugeben und die Phasen getrennt. Die organische Phase
wurde destilliert. Die isolierte Ausbeute dieser Reaktion betrug
96 %, HPLC-Reinheit 98 % (a/a).Beispiel 3: Terephthalodinitril
aus 4-Cyanobenzoes?ure-tert.-octylamid1
mol 4-Cyanobenzoes?ure-tert.-octylamid, und
2 mol NEt3 werden in 150 mL Ethylacetat
vorgelegt. 1,2 mol T3P-L?sung
in Ethylacetat (50 % w/w) werden zudosiert. Die Reaktionsmischung
wird 3 Stunden zum Sieden erhitzt und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden
180 mL Wasser zugeben und die Phasen getrennt. Die organische Phase
wurde destilliert. Die isolierte Ausbeute dieser Reaktion betrug
95 %, HPLC-Reinheit 97 % (a/a).Beispiel 4: 4-Brom-3,5-dimethoxybenzonitril
aus 4-Brom-3,5-dimethoxybenzoes?ure-tert.-octylamid1
mol 4-Brom-3,5-dimethoxybenzoes?ure-tert.-octylamid,
und 2 mol NEt3 werden in 150 mL Ethylacetat
vorgelegt. 1,2 mol T3P-L?sung
in Ethylacetat (50 % w/w) werden zudosiert. Die Reaktionsmischung
wird 3 Stunden zum Sieden erhitzt und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden
180 mL Wasser zugeben und die Phasen getrennt. Die organische Phase
wurde destilliert. Die isolierte Ausbeute dieser Reaktion betrug
95 %, HPLC-Reinheit 97 % (a/a).
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