建立胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系--《北京林业大学学报》2010年05期
建立胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系
【摘要】：以胡杨为研究材料,建立适用于胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系,对影响反应体系的关键因素(RNA提取、内切酶组合、预扩增体系、选择性扩增体系)进行了探索和优化。结果表明:通过改进后的CTAB法能成功获得高质量的RNA;EcoRⅠ/MseⅠ的组合4.5h内将ds-cDNA酶切完全,与相应接头连接过夜后产物直接用于预扩增;稀释10倍的预扩增产物作为模板用于选择性扩增;通过优化体系得到的选择性扩增产物,银染检测后条带清晰稳定,经RT-PCR检测,证明优化后的cDNA-AFLP技术差异显示的结果可以准确反映基因在植物体中差异表达的真实情况,并利用该技术成功筛选出42对可以获得带型丰富且重复性好的引物组合。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S792.11【正文快照】：
胡杨(Populus euphratica Oliv.)系杨柳科杨属中最古老、最原始的一个树种,是荒漠地区特有的珍贵树种,是我国首批确定的388种珍稀濒危植物中的渐危种之一,也是第三纪遗留下来的孑遗植物。在我国主要分布于新疆、青海、内蒙古、甘肃和宁夏等干旱荒漠地区,亚洲中西部、北非和欧
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京公网安备75号孩子被绑在父亲腰间，骑摩托车400多公里跋涉回家。
得知儿子即将与她团聚，老人感动的泣不成声。
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　　逆转录（reverse tranion）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录过程由逆转录酶催化。
　　AMV和M-MLV是两种常见的逆转录酶，两者区别在于：
　　1.来源：AMV来自禽成纤维病毒逆转录酶，M-MLV来自鼠白血病逆转录酶；
　　2.反应温度：AMV的热稳定性较好，反应温度可达55℃，对次级结构耐受；M-MLV的热稳定性较差，最适温度为37℃；
　　3.RNaseH活性：AMV的RNaseH活性比M-MLV高，由于RNaseH活性同反转录酶的聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA（DNA复合物中的RNA链）。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度，这点来说AMV不如M-MLV效果好。
　　总的来说，虽然AMV的热稳定性好，对抗二级结构和高GC的能力强，但其合成cDNA的长度短，得率低，因此M-MLV是市场主流产品。
　　M-MLV (H-) Reverse Tranase是通过定点突变得到的RNase H活性缺失的M-MLV突变体。与常见的通过删除RNase H结构域方法得到的突变体相比，本产品保留了完整的蛋白结构，因此具有与野生型相同的聚合酶活性，可用于较长的cDNA合成以及全长cDNA文库的构建等。
　　Reverse Tranase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Tranase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。Hi
　　Reverse Tranase在50℃下活性最高，且可耐受高达55℃的反应温度，可用于具有二级结构的RNA模板的逆转录。增强与模板的亲和力，可获得更多全长的cDNA，并可检测到低至1 pg的总RNA，特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外，Hi
　　Reverse Tranase的错配率也比M-MLV (RNase H-) Reverse Tranase有所降低，提高了克隆的保真度。
　　II Reverse Tranase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Tranase基础上通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。与上一代的Hi
　　Reverse Tranase相比，Hi
　　II保留了极高的热稳定性，在50℃的半衰期超过240分钟，并可在55℃长时间反应而保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，Hi
　　II增加了多个点突变，进一步增强了模板亲和力和行进性，使得全长cDNA的合成能力有了大幅度提升，可获得长达20 kb的全长cDNA，并且对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。
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【求助/交流】RNA逆转录成cDNA后如何鉴定
RNA逆转录成cDNA后需要鉴定下（逆转录时的引物是随机引物和oligo），
一般是用cDNA跑电泳呢，还是以cDNA为模板PCR之后再跑电泳？
电泳后是不是两者条带的位置不太一样呀？因为PCR之后为双链DNA，碱基数比cDNA多。
研究生必备与500万研究生在线互动！
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随时随地聊科研做PCR扩增产物是270bp,用什么样的Marker?我刚开始学做PCR,所以不清楚,请前辈们赐教了~不好意思啊！关于实验我知道的比较少，也没有师兄师姐带，所以就~我做RT-PCR，逆转录产物是cDNA，扩增以后还是DNA，所以用100bp ladder应该没问题吧！
用100bp ladder.————————————————————————————————100bp ladder和100bp marker实际上性质相同,都指最小片段是100bp,以100bp递增的DNA marker.不同公司的marker片段数量略有不同.DL2000是DNAmarker,所有DNA marker的单位都是bp.蛋白质marker的单位才是道尔顿.明白没?_____________________________________________________没问题
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