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尿形成的影响因素和急性肾功能衰竭
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ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
实验方法原理
血中磺胺类药物能与某些试剂发生反应，生成有色物质，通过比色对磺胺血浓度进行定量。根据用药后不同时间血中药物浓度的变化规律，计算血浆半衰期及其它药动学 参数。通过注射氯化汞复制急性肾衰的动物模型，比较正常及肾衰家兔内生肌酐清除率 的不同以及药动学参数的差别，以达到将生理、药理和病理生理的知识有机融合之目的。 碘胺类药物生成有色物质的反应如下： 一、重氮化：磺胺与亚硝酸反应，生成重氮盐，因亚硝酸易分解，无现成制剂，所以实验中用亚硝酸钠，使其与盐酸反应生成亚硝酸，磺胺也必须首先与盐酸反应，使其苯核上的氨基（-NH2）离子化生成铵类（-NH3+）化合物才能与亚硝酸发生重氮化反应。 具体反应如下： 1.
NaNO2+HCl→HNO2+NaCl
偶联反应：盐酸重氮苯磺胺与麝香草酚在碱性溶液中发生偶联反应生成橙黄色 的偶氮化合物。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、复制肾衰模型 实验前一天（18～20 h），取家兔（状态佳者）2 只，称重后一只皮下注射 1%HgCl2 溶液 1.2 ml/kg 体重，造成急性肾功能衰竭动物模型；另 1 只则在相同部位注射等量的生理 盐水作为正常对照。 二、收集尿液 1.
注射葡萄糖：分别取上述两兔称重，用乌拉坦 5 ml/kg 腹腔注射麻醉。固定于兔台上，耳缘静脉注射 5％葡萄糖溶液 15 ml/kg 体重(5 min 内注完)，以保证有足够的尿量。 2.
膀胱插管：腹部剪毛，在耻骨联合上 l.5 cm 处作腹正中切口，长约 4 cm。分离 皮下组织。沿腹白线切开腹膜，找到膀胱，作膀胱插管，先排空剩余尿液，然后收集 l h 尿液，并换算成每分钟排尿量。 三、采集血样 1.
颈动脉插管：将家兔背位固定于兔台上，剪去前颈部的毛，沿正中线由甲状软骨向下将颈部皮肤切开约 5 厘米。用血管钳钝性剥离皮下组织，分开肌肉，游离位于气管 侧方的一侧颈总动脉，将其同周围组织以及伴行的神经分离。为了防止动脉插管内凝血， 在手术进行到此时，从耳静脉注射 1% 肝素约 1 ml/kg。然后，将颈总动脉头侧端结扎， 心侧端用动脉夹夹住。在二者中间穿线打虚结，用眼科小剪刀在近头侧部结扎处向下剪 一小口，向颈动脉内插入充满肝素的三通管。结扎并加以固定。 2.
采集正常血液：从三通管放血约 0.5 ml，摇匀，备测药动学参数之用；另取 3 ml左右血液备测肌酐清除率之用。 3.
向家兔一侧耳缘静脉内快速注入 20％磺胺嘧啶钠１ ml/kg。 4.
在用药后第 1、3、5、15、30、60、90、120 分钟时，分别从连接颈动脉的三通 管采血约 0.5 ml、摇匀（应先放掉动脉插管内的残血）。 四、内生肌酐清除率测定 血、尿肌酐测定方法(见下表 5-2)和内生肌酐清除率的计算。 将尿样稀释：将尿液充分混合后，取出 1 ml 尿液，用蒸馏水将其稀释 100 倍，以备测定尿中肌酐含量。 将血样离心：将 3 ml 血液放入离心机中，3000 r/min，离心 20 分钟，取出血浆备用。 按下表加药：
混匀，置 37 ℃水浴 20 min，再放到冷水盆中转动 1 min 使冷却。在 520 nm 波长处各以其相应的空白管调零，比色测定标准管和测定管的光密度。 5.
计算血中肌酐含量：
注意事项（1）血清、标准液等试剂量应准确。（2）煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。（3）所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。影响检测结果。此时需做试剂空白较正。方法如下(表 5-3)：
以 B0 为空白，测定 B 管的光密度。新配的试荆空白光密度在 0.01 左右。依下式计算：
（4）公式中的 0.23 为血浆中蛋白质含量在正常范围的蛋白干扰系数，若血浆蛋白质含量过高或过低，则宜采用传统的无蛋白滤液测定法。 （5）苦味酸具有爆炸性。配制时应先在容器内加少许蒸馏水，以防意外。 五、磺胺嘧啶钠药动学参数的测定 1.
脱蛋白：准确吸取各血样 0.2 ml，分别加入蒸馏水 1.8 ml（标准管 1.6 ml），５％ 三氯醋酸 4.0 ml，摇匀后将液体放入离心管中进行离心：1000 r/min，3 分钟。 2.
重氮化及偶联呈色：分别吸取不同时间的离心后的上清液 2.0 ml 加入对应的试管 中，并依次向各试管中加入下述试剂： 2N 盐酸 0.5 ml. 0.5％亚硝酸钠 0.5 ml. 0.5％麝香草酚 1.0 ml，摇匀。 3.
标准管的处理：同其他样品管所不同的是，需要准确加入 30mg％的磺胺嘧啶钠0.2 ml，以保证计算结果的准确性。 4.
比色：将各管内药液分别置于 722 型分光光度计的 0.5 cm 比色杯内，在波长为480 nm 处比色，以给药前的样品管调零点，测出各样品管的光密度值。 记录：
计算： （1）在其它条件（波长、比色杯、吸收系数、溶液稀释倍数等）一致的情况下，同一 种溶液浓度与光密度成正比，故可用下述公式求出样品管的磺胺血浓度（mg%）。
（2）作图：将上述计算好的各时间的血样浓度换算成对数浓度，在方格纸上对时间做图，找出消除相和分布相之间的拐点。 （3）用残数法计算磺嘧啶钠的药动学参数。 ①用计算器对拐点后的消除相各时间及相应的血浓度进行直线回归，求出直线的截 距 a 和斜率 b；进而求出 B=10a，β=-2.303b（若为一房室，β为Ｋ）；根据 t1/2 =0.693/β,求出消除相半衰期 tl/2；最后写出消除相的经时方程 Ct=B·e-βt。 ②根据 Ct=B·e-βt 计算各个时间的血药浓度。 ③计算分布相的血药浓度：用拐点前实际测得的各血药浓度，减去其对应时间的消 除相的血药浓度，其差值即为分布相的血药浓度。用该浓度的对数对时间进行直线回归， 可求得 logA，α，进一步求出 A、tl/2、和分布相的经时方程 C t = Ae-αt。 ④写出磺胺嘧啶钠在体内的总经时方程：C=Ae-αt ＋B·e-βt。 依该方程计算各时间 的理论血浓度值，可比较与实测值的差别。 ⑤依药动学的公式计算磺胺嘧啶钠在家兔体内的各种动力学参数。
血清、标准液等试剂量应准确。 2.
煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。3.
所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。
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正常及肾衰家兔磺胺嘧啶钠药动学参数的测定实验 的问题，快来添加第一个问题吧！
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标题: 家兔急性肾小管坏死实验
摘要: 【目的要求】1．复制急性中毒性肾功能衰竭的动物模型2．观察升汞中毒家兔的一般状态，尿液的变化，测定酚红及血清尿素氮、血清钾水平以了解肾功能情况，并观察肾脏的形态改变。3．加深理解急性肾衰的病因、发病机制和机能代谢变化。【实验原理】 采用重金属类肾毒物HgCl2，造成家兔急性……
【目的要求】
1．复制急性中毒性肾功能衰竭的动物模型
2．观察升汞中毒家兔的一般状态，尿液的变化，测定酚红及血清尿素氮、血清钾水平以了解肾功能情况，并观察肾脏的形态改变。
3．加深理解急性肾衰的病因、发病机制和机能代谢变化。
【实验原理】
采用重金属类肾毒物HgCl2，造成家兔急性肾小管坏死。
【实验动物】
家兔，体重 1.5～2.0 kg。
【药品与器材】
1% HgCl2溶液，生理盐水，0.6%酚红溶液，50%葡萄糖液，尿素氮标准应用液Ⅰ（1ml = 0.025mg氮），二乙酰-肟- 硫氨脲（DAM-TSC）液，酸混合液，5%醋酸溶液，尿素氮标准应用液Ⅱ（1ml = 0.005mg氮）。
兔手术台，i-STAT血气分析仪、721型分光光度计，ATC-1E型屈折度计（尿比重检测计），离心机，显微镜，水浴锅，电子称、手术器械一套，动脉插管1根，输尿管塑料插管，50ml、200ml、1000ml微量移液器，注射器，5ml刻度吸管，洗耳球，滴管，玻片，玻璃试管，试管夹，试管架，酒精灯。
【实验步骤】
1．家兔急性中毒性的制备
实验分为两组家兔，一组为正常对照组，一组为肾中毒实验组。于实验前一天，家兔称重后，按剂量1.2ml/Kg，皮下或肌肉注射一次氯化高汞（HgCl2），造成急性中毒性肾小管坏死病理模型。对照组家兔则在相同部位注射同量的生理盐水。
（1）此步骤由实验技术人员在实验课前一天完成操作，但同学须掌握造病方法。
（2）实验课时，学生各分组中，有一组用对照组动物进行实验，其结果应提供其它小组使用来进行对照分析；对照组的分组学生也可使其它任何一组的造病动物来源的实验资料，进行分析。
（3）实验动物耳部记录有该动物的体重，各组可用以作记录体重的依据。
2．颈动脉插管术与血样本的制备
（1）取正常或中毒家兔在记录体重后，固定于兔手术台；
（2）颈部去毛，手术部位局麻；
（3）在甲状软骨水平下作颈部正中切口，长约4cm，正对气管软骨环，逐层钝性分离，暴露喉结以下气管软骨环后，再向两侧分离，并在胸锁乳突肌内侧下方分离出一侧颈总动脉，长度约2.5～3cm。
（4）动脉插管前，远心端必须先结扎，用动脉夹夹住近心端。
（5）然后用眼科剪刀剪开动脉壁的三分之一大小，注意遮掩，小心出现喷血。
（6）插入前端已剪成斜口的导管，结扎插入导管部的血管，使导管被固定。
（7）血气分析 打开颈总动脉的动脉夹，弃去最先流出的2、3滴血液后，然后立即将插管口直接对准电极板芯片的注血口，注入全血到标准刻度，盖上小盖，插入i-STAT血气分析仪，进行血气分析。
（8）再经动脉插管取正常或中毒家兔血2~3ml，待凝固15～20min后，离心3000rpm，5～10min，分离血清。用滴管将血清吸出，分别移入干燥的小试管中备用。
所制备的血清用来测定血清尿素氮和血清钾，方法见附录部分的介绍。
3．首次取尿液样品和输尿管插管术
（1）下腹部剪毛，局部麻*醉，在耻骨联合上1.5cm处作正中切口，长约4cm。分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，暴露出膀胱。用注射器吸出膀胱内全部尿液置于试管（10ml的尖底离心管）中备用。
此尿液样用来测定尿比重、尿蛋白定性和尿沉渣镜检，方法见附录部分的介绍。
（2）输尿管插管术：将膀胱向前下方翻向体外，在膀胱底部找到并分离一侧输尿管，在输尿管靠近膀胱处用线结扎，略等片刻，待输尿管略充盈后，用眼科剪剪一小口，向肾脏方向插入一根细塑料管，结扎固定插管，以备收集尿液。如果插管失败，可改为在实验末收集膀胱内尿液，作测定用。
4．酚红排泄试验
从兔耳缘静脉准确快速注入0.6%酚红溶液（1ml/只），并开始计时，然后从耳缘静脉缓慢输注50%葡萄糖液20ml，使引起利尿作用。此后收集60min尿液，进行PSP测定，方法见附录部分的介绍。
注意：如因总实验时间的限制，可以统一用收集30min的尿液，估计实验动物酚红排泄的情况。
5．肾脏的形态观察
实验结束后，用经耳缘静脉注射5~10ml空气的方法，将对照和实验性肾功能衰竭家兔处死，取出肾脏，称肾脏的重量，测定肾与体重的比值（肾体比，体重指去肠道后的体重）。
观察肾中毒家兔肾脏的体积大小，表面色泽；在矢状方向横剖切开肾为两半后，观察皮质条纹及色泽；在再度合拢两半肾后，观察切口能否完全对合。以病肾与正常肾脏作比较。
1．血清尿素氮测定
（1）原理：血液和尿中的尿素在强酸条件下与二乙酰-肟（Diacetylmonoxim）和硫氨尿（Thio-Semicarbazixe）共煮，生成红色复合物。颜色深浅与尿素氮含量成正比关系。
（2）操作方法
按表所示，分别在空白管、标准管、测定管A和测定管B按顺序加入各种，混匀，然后置沸水锅中准确计时煮沸10min，置流水中冷3min后比色，用520nm波长比色，以空白管调零。
血清尿素氮测定时各管加样顺序表
试剂（ml）
标准应用液II
注：测定管A为正常家兔的血清，测定管B为肾中毒的家兔血清
（3）血清尿素氮测定的计算方法
测定管光密度(Du)/标准管光密度(Ds)*0.002*(100/0.02)=Du/Ds*10=血清尿素氮(mg%)
2．尿比重测定
用吸管取尿液滴加于ATC-1E型屈折度计（尿比重检测计）的检测面上，盖上盖后，通过接目镜观察尿比重数值，记录尿比重读数。
3．尿蛋白定性检查
取正常或肾中毒家兔的尿液各约2～3ml，分别放入试管中，以试管夹夹住试管，在酒精灯上加热至沸腾（注意试管口不要对着人，小心加热，切勿让试管内尿液溢出）。若有混浊，加入5%醋酸3~5滴，再煮沸。若尿变清，说明原先出现的混浊是因尿内无机盐引起；加酸后若混浊加重，则表示尿中含有蛋白质，根据尿液混浊程度可估计尿蛋白量的多少。
&-&尿液清晰，不显混浊，无明显蛋白尿。
&+&尿液出现轻度、白色的混浊（含蛋白质0.01~0.05g%）。
&++&尿液呈稀薄乳样混浊（含蛋白质0.05~0.2g%）。
&+++&尿液乳浊，或有少量絮片存在（含蛋白质0.2~0.5g%）。
&++++&尿液出现絮状混浊（含蛋白质&0.5g%）。
4．尿液镜检
（1）将收集的尿液取出一滴置于玻片中，与显微镜下，细胞计数至少检查10个高倍视野；管型计数至少检查10个低倍视野，用最低至最高数报告。如WBC 2~6/HP；管型0~3/LP。
（2）亦可取一定量的尿液分别置于两支中，离心沉淀600rpm? 5min，取尿沉渣涂片，先低倍后高倍镜观察，计数10个不同视野的管型和细胞的近似平均值，其中管型以低倍视野计数。
5．PSP试验
将60min（或30min）内收集的全部尿液（包括可能在膀胱中最后抽取的尿液），全量置于500ml量筒（或刻度烧杯）内，加入10%氢氧化钠5ml，并加水至500ml，搅拌均匀后从中取出10ml溶液置于中，与一系列不同酚红浓度的标准管比较，判定由尿排出的酚红的百份比。
按下表配制的酚红标准液，可计算出一小时内排出酚红的百分率（近似值）。
【试剂的配制方法】
1．血清尿素氮测定用试剂
（1）二乙酰-肟-硫氨尿液
称取二乙酰600mg，硫氨尿30mg，蒸馏水溶解并加至100ml。
（2）酸混合液
浓磷酸（85-87%）35ml，浓硫酸80ml，慢慢滴加于800ml水中，冷却后加水至1000ml。
（3）尿素氮标准液的制备
①储存液（1mg氮/ml）
称取分析纯尿素2.143g，加0.01N硫酸溶解，并加至1000ml，置冰箱内保存。
②尿素氮标准应用液Ⅰ（0.025mg氮/ml）
吸取尿素氮标准储存液2.5ml，加0.01N硫酸至100ml。
③尿素氮标准应用液Ⅱ（0.025mg氮/ml）
吸取尿素氮标准应用液Ⅰ20ml，加0.01N硫酸至100ml。
2．酚红标准液的配制（如下表）
各种浓度酚红标准液的配制
100%酚红（ml）
0.05%氢氧化钠（ml）
标准浓度值（%）
【注意事项】
1．、标准液等试剂量应准确。
2．加入标准应用液Ⅱ之后，应不超过1~2min，立即放入沸水中进行后面的操作。
3．煮沸及冷却时间应准确，否则颜色反应消退。
4．正常家兔尿素氮14~20mg%，急性升汞中毒性肾病家兔血清尿素氮约为正常值的1~2倍。
【思考题】
1．根据实验结果，分析升汞引起急性肾功能衰竭的机制。
2．依据血气分析结果，讨论引起机能代谢发生了哪些变化？为什么？
3. 结合本实验结果，分析产生尿蛋白、管型的机理。
4. 引起急性肾功能衰竭发生的常见原因有哪些？如何分类？
5. 急性肾功能衰竭病人进入多尿期，尽管尿量已有明显增多，但可存在氮质血症，其原因是为什么？
【实验结果记录】
急性肾功能衰竭实验指标的测定记录表
尿蛋白检查
60min酚红排泄率
血清尿素氮测定
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