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500 G SEPHADEX G-50 MEDIUM 500G 蛋白G亲和层析填料PROTEIN G SEPHAROSE 4FF 200M EXO I 试剂COLUMN PD10 CYTODEX 1 5KG PHARMALYTE 5-8 HIGH PI CALIBRATION KIT 试剂PHARMALYTE 8-10.5 高效亲和琼脂糖HP试剂 试剂HITRAP HEPARIN HP 1＊5ML 苯基琼脂糖CL-4B试剂 SEPHADEX G50 M DNA GRADE 100 琼脂糖 DEAE-SEPHADEX A-25 葡聚糖凝胶 LH-20 交联葡聚糖琼脂糖75 10/300试剂 高效高交联度镍琼脂糖试剂 MABSELECT SURE 200ML 高交联度琼脂糖S试剂 Capto Q 100ML 阴离子快速亲和琼脂糖试剂 试剂GSTRAP FF 1＊5ML 试剂Formamide TRIS(双向电泳级） 快速亲和琼脂糖Q试剂 快速亲和琼脂糖SP试剂 试剂PHENYL SEPHAROSE 6FF(LS) 快速高分离度苯基琼脂糖6试剂 NAP-5 20ST BLUE SEPHAROSE 6FAST FLOW 高效快速氨基类琼脂糖试剂 试剂hiprep 16／60 sephacryl S-100H 试剂ACRYLAMIDE PAGE 试剂Heparin Sepharose 6FF，50ml 试剂hitrap Q HP 聚乙烯二乙烯苯Q聚合度试剂 试剂HITRAP IEX SELECTION 柱底网孔140 NET 10 ADAPTOR 140 COLUMN PA 色谱仪专用样品环管 试剂CHROM TUBE XK 26／40 色谱柱 XK16/40 层析柱XK26／100 色谱仪专用样品环管 试剂superloop 10ML AKTA 色谱仪专用过滤器SE2619T02 T型白色垫片，PVC材质1×105mmSE202N10 ALUMINA PLATES, 10 X 8 CM (PKGSE211A1503 电泳仪15孔梳子，厚度1.0MMSE211A101 电泳仪10孔梳子， 厚度1.0MMPA13105 试剂CY3 MONO ESTER 5mg 层析仪专用分析样品膜R100188 缓冲液 Adapter XK 26 试剂comb，spineless，15well，1.0MM XK 50/60 column XK 50/100 column Adapter XK 50 XK 26/100 column TRICORN 10/50 COLUMN PD SpinTrap G25 试剂tricorn 10/100 column 色谱仪专用阀门L型US1640702 试剂GLYCINE ULTRAPUREUS1788601 ISOPROPYL-BETA-D-THIOGALACTOUS1640703 试剂GLYCINE ULTRAPUREQ12143 试剂QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)SE2619T01 T型白色垫片，PVC材质0.75×105mmUS1538501 试剂Dithioerythritol （DTE)SE6119201 垫片，2CM×16CM，厚度1.0MMQ69106 DNeasy Plant Mini Kit(250) CHROM TUBE XK 26/70 试剂DI-G TP TRICORN 10 COLUMN ADAPTOR UNIT 试剂MICROSPIN G-50 COLUMNS，50COL GSTRAP 4B亲和层析预装柱 色谱柱XK 50/30 基础葡聚糖26/600试剂 色谱仪专用装柱池 RK50 GLASS PLASTES ,LOFLUOR 试剂ettan dalt gel cast casE70028Z 试剂Reca ProteinPA25001 CY5 Mono 5-PackE70092X 试剂SHRIMP ALKALINE PHOSPHATASESE262GN5 NOTCHD GLASS PLATS 10x10CM (PKSE202N 试剂alumina plate 10x8cm试剂 适配器O-ring线圈120×5mm 色谱仪专用样品环管 色谱柱专用支架 色谱仪专用样品环管 Adaptor set 4mm m/2mm EPS 601 POWER SUPPLY 层析柱XK 50-100 COLUM LABMATE PD-10 BUFFER RESERVOIR 色谱柱 XK50 30 EP301型电源 短光纤20cm 层析仪专用分离器 色谱柱C 16/20 CHROM TUBE XK 试剂end piece compilete 色谱柱专用支撑网接口AK16 色谱管连接口 connector 25 mm clamp-m6 色谱管连接口 试剂INNER ADJUSTING TUBE HEXAGONAL ELECTRODE PLUS 试剂IPG-BUFFER，PH6-11 (4-8℃) 试剂silver staining 试剂hitrap sp hp，5x1ml 试剂TEMED 试剂triton X-100 苯基琼脂糖6FF 试剂Q SEPHAROSE HIGH PERF 试剂Streamline Q XL 试剂HITRAP RPROTEIN A FF 试剂HITRAP BENZAMIDINE FF Gstrap高流速预装柱5×5ml GSTRAP HP 5X5ML 试剂protein A sepharose 4FF Capto MMC离子交换填料，100ml FicollPaque PREMIUM 1,073 6X1 高效琼脂糖4B试剂 试剂ni sepharose HP MONO Q离子交换预装柱10/100 Hollow fiber cartridges中空纤维素柱 SEMIPERM. ADAP. CE PSA440 试剂QAE-SEPHADEX A-25 层析琼脂糖PM400试剂 试剂CM-Sephadex C-25 特级葡聚糖G-25试剂 试剂Sephadex G-15 试剂Sephadex G-75 Superfine 试剂DEAE SEPHAROSE FAST FLOW 试剂EAH-sepharose 4B 试剂CHELATING SEPHAROSE FAST FLOW Sephacryl S-500 HR 高效高交联度琼脂糖 试剂Hitrap Protein A HP 试剂HITRAP PROTEIN A HP 阴离子琼脂糖4B试剂 (4-8℃) 溴化氢活化填料CNBR-ACT SEPHAROSE 4B试剂 试剂hitrap chelating hP 5x5ml 试剂epoxy-activated sepharose 6B VALVE 4-PORT 2-WAY ID 6MM 试剂Q SEPHAROSE FAST FLOW 试剂Superose 12 prep grade PHASTGEL IEF 3-9 琼脂糖NA试剂引用本文 0
刘冬梅, 孙佳楠, 邹佳凝, 刘明伟, 孙璐, 刘琼明. GSTpull-down联合质谱鉴定BAG结构域相互作用蛋白[J]. 中国生物工程杂志, ): 1-10.
LIU Dong-mei, SUN Jia-nan, ZOU Jia-ning, LIU Ming-wei, SUN Lu, LIU Qiong-ming. Screening Interacting Proteins for BAG Domains of BAG Family Proteins by GST pull-down Coupled with LC-MS/MS[J]. China Biotechnology, ): 1-10.
GSTpull-down联合质谱鉴定BAG结构域相互作用蛋白
刘冬梅1, 孙佳楠1, 邹佳凝2, 刘明伟3, 孙璐1 , 刘琼明2 &&&&
1. 沈阳药科大学药学院 沈阳 110016;2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;3. 国家蛋白质组学重点实验室 北京蛋白质组研究中心 北京 102206
基金项目：国家自然科学基金面上项目()资助项目.
通讯作者, 电子信箱: ;
摘要：目的:BAG结构域(BAG domain,BD)为BAG家族蛋白的基本功能结构域,通过对BAG家族蛋白6个成员的9个BDs的相互作用蛋白进行分析,以探明不同BD相互作用蛋白的异同点并为研究BAG家族蛋白多样性生物功能的分子机制提供理论依据。方法:构建p-GEX-4T2-BDs重组子并转化E. coli BL21 (DE3) 经IPTG诱导表达GST-BDs融合蛋白并纯化。采用GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的策略对BDs相互作用蛋白进行定性定量分析。最后,用DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Intergrated Discovery)和cytoscape对BDs相互作用蛋白进行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes)通路分析。结果:在Hela细胞的胞浆蛋白中总共鉴定到370个潜在的BDs相互作用蛋白,主要为核糖体蛋白(ribosomal proteins)、翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factors)、翻译延长因子(Eukaryotic translation elongation factors)、泛素化-蛋白酶体相关蛋白(ubiquitin-proteasome associated proteins)及HSP40家族蛋白。GO功能富集分析结果显示,BDs相互作用蛋白涉及多种生物学功能,包括细胞内蛋白质质量控制(protein quality control)、糖代谢(glycolysis)、免疫调控(immune response)、应激反应(stress response)、细胞周期(cell cycle)等。KEGG通路分析结果表明BDs相互作用蛋白参与多条细胞内重要的信号通路,包括FGF信号通路(FGF signaling pathway)、EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)、PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)、Ras通路(Ras pathway)等。结论:BAG家族蛋白不同成员的BD所介导的蛋白-蛋白相互作用既有共性又有特异性,BAG家族蛋白通过BDs介导多种蛋白相互作用并参与细胞内多条重要的信号通路来调控细胞内蛋白质稳态、糖代谢、免疫反应、应激反应、细胞周期等过程。
BAG家族蛋白&&&&
BAG 结构域(BDs)&&&&
GST pull-down&&&&
LC-MS/MS&&&&
Screening Interacting Proteins for BAG Domains of BAG Family Proteins by GST pull-down Coupled with LC-MS/MS
LIU Dong-mei1, SUN Jia-nan1, ZOU Jia-ning2, LIU Ming-wei3, SUN Lu1, LIU Qiong-ming2 &&&&
1. College of Pharmacy of Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, C2. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, C3. Beijing Proteome Research Center, State Key Laboratory of Proteomics, Beijing 102206, China
Abstract:The Bcl-2-associated athanogene (BAG) family proteins are BAG-domain (BD) containing protein and are evolutionally conserved among eukaryotes. BAG family proteins play a critical role in a wide variety of cellular processes, such as cell survival, proliferation, migration, apoptosis, stress response and neural differentiation. BDs are responsible in binding HSP70 to BAG proteins. However, how BDs mediate the protein complexes assembly to govern the diverse functions of BAG proteins is needed further studies. To explore the roles of BDs in BAG family proteins, GST-BDs pull-down coupled with LC-MS/MS were performed to screen the BDs associated proteins in cytosolic extracts from Hela cells. 370 potential BDs interacting proteins were identified. GO (Gene Ontology) annotation analysis shows that BDs interacting proteins function in cellular protein quality control, glycolysis, immune response, stress response, ubiquitin-proteasome regulation, cell cycle process. In particular, KEGG (Kyoto Enyoolpedia of genes and Genomes) pathway enrichment analysis reveals that BDs interacting proteins involve in several important pathways, including FGF signaling pathway, EGF receptor signaling pathway, PDGF signaling pathway and Ras pathway. In addition,different BDs can specifically binding different partners. Overall, this expands knowledge of the BDs interactome, provides a valuable resource for understanding the roles of BDs in mediating BAG proteins' different cellular functions.
Key words:
BAG family proteins&&&&
BAG domain (BD)&&&&
GST pull-down&&&&
LC-MS/MS&&&&
BAG家族蛋白(Bcl-2 associated athanogene family proteins)最初是在研究抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用蛋白中被发现的[]，因此BAG家族蛋白也被称为抗凋亡蛋白。人类基因编码6个BAG家族蛋白，分别为BAG-1(RAP46/HAP46)、BAG-2、BAG-3 (CAIR-1/Bis)、 BAG-4 (SODD)、BAG-5和 BAG-6 (BAT3/Scythe)[]。这些蛋白不论是在结构还是在功能上都既有共性又各有特性。从结构上看，所有BAG家族蛋白在其C-末端都有一个约80～120氨基酸长度的进化上高度保守的序列，称为BAG结构域[]，本文中分别将BAG1,BAG2,BAG3,BAG4,BAG6的BD分别命名为BD1,BD2,BD3,BD4和BD6; BAG5的4个BD分别命名为BD5.1,BD5.2,BD5.3和BD5.4。Sondermann等于2001年首次用NMR及X射线衍射解析出BD1的结构，提出BD1由3个反向平行的α-螺旋组成，并通过其α-螺旋2和3与HSP70作用[]；BD2不同于其他BDs，以二聚体的形式存在，因此也被称为BNB结构域(brand new BAG),BD2与HSP70的亲和力低于其他BDs[]；BD4的3个α-螺旋虽比BD1短约25个氨基酸，但是依然包含了与HSP70相互作用的重要位点[, ]; BAG5是BAG家族中比较特殊的成员，包含4个功能未知的连续的短的BDs，结构与BD3和BD4相似[, ]；BD6也是一个非典型的BD，但目前对BD6的研究较少。此外，BAG家族蛋白N-末端具有不同的结构域或序列模块，例如BAG1和BAG6均含有NLS序列(Nuclear localization signal)和UBL结构域(Ubiquitin-like domain)[, ]，BAG2含有一个CC结构域 (coiled-coil dimerization domain)[]，BAG3含有WW结构域和PXXP结构域[]，不同的结构域介导不同的蛋白相互作用。从蛋白功能上看，不同BAG家族蛋白既有相似的功能，又有其特异的功能。首先，BAG家族蛋白在功能上具有共性，例如BAG1,BAG2和BAG3均可以与抗凋亡蛋白Bcl-2结合,并与HSP70形成复合物而发挥抗凋亡作用，BD似乎是介导这些蛋白间相互作用的关键区域，但是目前人们依然不知道其具体的机制[]；BAG1和BAG6均可以抑制由分子伴侣介导的变性的β-半乳糖苷酶的重折叠，并且这一过程依赖于BD[]。其次，BAG家族蛋白具有功能差异性，例如BAG1和核受体相互作用，使核受体调控细胞增殖和存活的能力增强，成为促进乳腺癌、前列腺癌等发生的一个重要原因[, ]；BAG2可以抑制E3泛素连接酶CHIP的活性，相反，BAG1却可以与CHIP起到协同作用而加速酶底物的降解[]；BAG3在横纹肌组织中高表达，并且是唯一的压力诱导型(heat stress-inducible)BAG结构域蛋白，小鼠中BAG3缺失会导致严重的横纹肌疾病及造血干细胞减少[, ]；BAG4可以和胞浆内细胞死亡信号受体TNFR1，DR3结合，阻止配体依赖性受体信号通路和凋亡[]；BAG5与E3泛素连接酶Parkin结合，调控底物蛋白的泛素化[]；细胞核内BAG6-UBL4A-GET4复合物介导DNA损伤应答(DNA damage response，DDR)以及损伤引起的细胞死亡[]。总而言之，BAG是一类多结构域蛋白家族，通过结构域介导的蛋白相互作用发挥多种生物学功能。但是目前为止，人们研究最多的是BAG1、BAG3和BAG6，而对BAG2、BAG4和BAG5的功能了解较少，值得我们注意的是，目前的研究结果表明除了BAG结构域外，BAG4 和BAG5不含有其他功能结构域。因此本文提出以BD为研究对象，不仅可以揭示BD在BAG家族中占据怎样的地位，或许还可以扩展人们对于BAG2、4、5的功能认知。
近年来的研究发现BAG家族蛋白在多种人类疾病中异常表达，包括肝癌[]、非小细胞肺癌[]、甲状腺癌[]、胃癌、卵巢癌、结肠癌[]、乳腺癌[]等的肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤的恶性程度有关，有望成为肿瘤治疗的靶点。Kudoh等[]在乳腺癌细胞系ZR-75-1中过表达BAG1或BAG1L，会增加其存活率，机理可能是BAG1或BAG1L抑制了由培养基血清激活的半胱天冬酶介导的细胞凋亡；进一步的老鼠体内实验结果也表明干扰BAG1或BAG1L功能可作为治疗乳腺癌的一种策略；Ozawa[]发现与其他胃肠道癌细胞比较，胰腺癌细胞的BAG4基因存在过表达的情况，而BAG4与TNFR-1相结合，抑制细胞自发的本底水平的细胞凋亡，而TNF-a诱导会导致BAG4与TNFR-1分离，从而激活细胞凋亡。因此寻找可靠的BAG相互作用蛋白在临床疾病治疗上具有重要意义。
综上所述，尽管BAG家族蛋白多是以蛋白复合物的形式在多种生理及病理过程中发挥重要作用，但是人们对于BAG家族蛋白发挥作用的分子机制依然知之甚少。此外，BD作为BAG家族蛋白共有的基本功能结构域，是如何介导BAG家族蛋白相互作用的，不同BD介导的蛋白-蛋白相互作用有什么样的共性或特性？为了深入探讨这些问题，我们采用体外GST pull-down联合质谱技术鉴定BD的相互作用蛋白，为研究BAG家族蛋白功能以及其潜在的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材 料E. coli BL21 (DE3)由本实验室提供，glutathione-Sepharose 4B columns购自GE Healthcare，蛋白胨和酵母提取物，isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED，EDTA二钠盐，十二烷基磺酸钠(SDS)，考马斯亮蓝 G-250，β-巯基乙醇等购于AMESCO公司，测序级胰酶购自Promega公司(Madison,WI)，细胞培养基DMEN，胎牛血清(PAA)，青霉素／链霉素(penicillin/streptomycin)均购于北京钮因泰克生物技术有限公司。
试 剂低渗溶液：(10 mmol/L Tris pH 7.3,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl)，BC-150： (20 mmol/L Tris pH 7.3,150 mmol/L KCl,0.2 mmol/L EDTA,20% glycerol),NETN溶液：(20 mmol/L Tris pH 8.0,100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.5% Nonidet P-40)。所有用于蛋白提取的溶液用前均加10 mmol/L β-巯基乙醇 (β-mercaptoethanol)及1 mmol/L phenylmethyl sulfonylfluoride(蛋白酶抑制剂PMSF)。
仪 器LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Scientific公司)，细胞培养箱(Thermo electron corporation公司)，超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，台式恒温振荡仪(太仓市实验设备厂)，HS-3垂直混悬仪(宁波新芝科技股份有限公司)，离心机(Thermo Scientific公司),SDS-PAGE电泳仪(BIO-RAD公司)。
重组质粒的构建以人cDNA为模板，PCR扩增BD1(245~326),BD2(109~189),BD3(421~489),BD4(379~456),BD5.1(50~127),BD5.2(233~301),BD5.3(316~391),BD5.4(406~483),BD6()的DNA区域，扩增产物经回收纯化之后克隆到p-GEX-4T2载体的EcoR I和Sal I的位点之间。转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆测序，获得重组质粒p-GEX-4T2-BDs。
GST融合蛋白表达，纯化和定量将转化有p-GEX-4T2-BDs 表达质粒的E. coli BL21 (DE3) 经0.5 mmol/L isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) 37 ℃诱导4h。 将得到的GST融合蛋白用glutathione-Sepharose 4B columns(GE Healthcare)，根据厂家的说明书进行纯化。纯化后的GST融合蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(10% SDS-PAGE)和BSA标准品进行定性和定量。
细胞培养Hela细胞(来自于本实验室)用含10%胎牛血清和1%青霉素／链霉素的DMEM在5% CO2,37℃细胞培养箱中培养。
胞浆蛋白提取将Hela细胞用PBS缓冲溶液洗涤后，1 000 g 离心4 min，收集细胞沉淀并用10×体积的低渗溶液重悬，冰上静置10 min 后，4 ℃,1 000g 离心15 min后收集细胞沉淀。将得到的细胞沉淀用杜恩斯匀浆器在冰上匀浆10下，然后将匀浆液4℃,4 000g 离心15 min后，取上清。之后将上一步得到的上清中加入0.11×体积的10× buffer，混匀后，4℃,100 000g离心60min。最后得到的上清即为Hela细胞的胞浆蛋白，将此上清在4 ℃，BC-150 中透析1h。收集透析后的胞浆蛋白，液氮速冻后保存于－80℃备用。
GST pull-down 实验将含GST或GST融合蛋白(诱饵蛋白)(80μg)的Sepharose beads和1mg Hela细胞的胞浆蛋白提取物于4 ℃ 垂直混悬仪上孵育60min，然后4 ℃,500g 离心2min后收集Sepharose beads，用NETN (100mmol/L NaCl) 洗5次后再用PBS洗5次。将捕获了与诱饵蛋白相互作用的目的蛋白的Sepharose beads经SDS-PAGE电泳初分离后进行胶内酶解。
Nano LC-MS/MS分析将胰酶酶解后的肽段用LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Scientific)进行分析。纳升级色谱分离采用自制的C-18色谱柱(内径：75 μm，外径：360 μm，柱长：10 cm，填料粒径：3 μm)。流动相A：0.1%甲酸水溶液。流动相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液。线性梯度：95% B(0 min) 92% (5min) 77% (21min) 47% (55min) 37% (65min) 5% (75min)。流速：350 nl/min。质谱仪由Xcalibur Qual Browser (v. 1.0.042 ) 软件在数据依赖性获取(Data-dependent acquisition，DDA)模式下操控，粒子碎裂模式为碰撞诱导解离(collision-induced dissociation，CID)，质量扫描范围为375~1600 m/z。搜索引擎引为Mascot，搜库软件为Proteome Discoverer 1.4，人源数据库来自于NCBI_ human reference sequence protein database,更新于07-04-2013。
1.2.7 数据分析
蛋白定量方法采用基于强度的绝对定量方法(Intensity based absolute quantification,iBAQ)[]对鉴定到的蛋白进行定量。简言之，就是用每个蛋白鉴定到的肽段的峰面积总和(AUCs)除以可能的全部酶解肽段的理论酶解数。依据实验组与对照组之间iBAQ的比值判定相互作用蛋白。
2.1 GST融合蛋白表达及体外GST pull-down策略
BD通过与HSP70结合，介导BAG家族蛋白参与细胞内蛋白动态平衡的调节，细胞内过表达影响蛋白折叠的BD会对细胞内环境平衡产生重大影响，为了规避这个问题，我们采用体外过表达GST融合的BD蛋白，通过体外GST pull-down，从Hela细胞裂解液亲和纯化BD相互作用蛋白，最后通过液相色谱-串联质谱对这些相互作用蛋白进行鉴定和定量分析(图 1a、图 1b)。首先诱导表达用于GST pull-down 的诱饵蛋白，即GST-BDs融合蛋白。图 1c为经过诱导表达并纯化后的GST-BDs融合蛋白，其中GST-BD1，GST-BD5.3和GST-BD5.4有部分的降解，GST-BD5.2的表达量略低于其他GST-BDs融合蛋白。为了减少不同BD融合蛋白的用量对亲和富集的影响，我们采用过量的诱饵GST-BD蛋白(80μg／实验)亲和纯化一定量的Hela细胞裂解液(1mg)，使得同一次实验中不同诱饵蛋白和重复实验组间相同诱饵蛋白之间具有可比性。其次，pull-down 后的样品经洗脱后进行SDS-PAGE电泳分离，如图 1d所示，GST-BDs融合蛋白实验组pull-down结果和GST对照组具有显著的不同，而且不同的GST-BD之间的条带也具有明显的差异。这些结果说明，第一：通过pull-down方法可以得到与BDs相互作用的蛋白；第二：不同的BAG结构域的相互作用蛋白条带分布不同。
图 1 BAG结构域及体外GST pull-down联合质谱鉴定策略
Fig. 1 domains of BAG family proteins and the workflow of GST pull-down coupled with LC-MS/MS
(a) BAG domain (BD) structures of BAG family proteins (b) Overall workflow of GST-BDs pull-down coupled with LC-MS/MS (c) GST and GST-BDs proteins were affinity-purified and analyzed by SDS-PAGE (d) Isolation of BDs-interacting proteins by SDS-PAGE
2.2 BAG结构域相互作用蛋白的鉴定及分析
为了鉴定这些相互作用蛋白，将SDS-PAGE胶上的蛋白条带胶内酶解后进行质谱分析。采用基于离子流色谱峰面积的无标定量蛋白质组分析策略，对相互作用蛋白进行筛选，这里采用iBAQ的定量方法对鉴定到的蛋白进行定量[]，每个蛋白的iBAQ值为质谱鉴定到的该蛋白所有肽段的峰面积总和除以其理论肽段数。为了提高相互作用数据的可靠性，所有GST pull-down进行了3次重复，并且采用严谨的阳性相互作用判定标准：(1)至少在两次实验中被鉴定到；(2)鉴定到的特异性肽段在2个以上(unique peptide≥2)；(3)与对照(GST)相比，iBAQ比值≥20(iBAQ GST-BDs/iBAQ GST≥20)。经分析和筛选，共鉴定到370个BD相互作用蛋白，其中包括许多已知的BAG蛋白的相互作用蛋白，如与BAG6形成蛋白复合物的SGTA、UBL4A、ASAN1[, , ]；BAG1的相互作用蛋白AR[]；以及众所周知的与BD直接相互作用的HSP70蛋白HSPA8、HSPA1A、HSPA1L。说明这些相互作用蛋白具有很高的可信度。对这些相互作用蛋白进行非偏向聚类分析，除了HSP70等这类已知的BD结合蛋白被大量富集到外，其他明显富集到的蛋白包括：核糖体蛋白(ribosomal proteins)、翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factors)、翻译延长因子(Eukaryotic translation elongation factors)、泛素化-蛋白酶体相关蛋白(ubiquitin-proteasome associated proteins)及HSP40家族蛋白(图 2a)。
图 2 BD相互作用蛋白的鉴定与分析
Fig. 2 Identification and analysis of BDs interacting proteins
(a) Heatmap of BDs interactomes clustering by Eulidean distance with gene cluster 3.0 (b) Number of proteins enriched in each BD (c) Proteins specifically enriched in different BDs
核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，在细胞内的蛋白质生物合成中发挥重要作用，近年来的研究表明核糖体具有参与DNA修复、细胞发育调控和细胞分化等核糖体外功能[, ]。翻译起始因子(eIF)是一类通过与核糖体蛋白、mRNA和起始tRNA相互作用来完成真核翻译起始的一类由多亚基组成的蛋白[]，在我们鉴定到的18个eIF亚基中，有12个为在翻译起始中起核心作用的eIF3亚基。泛素-蛋白酶体系统是细胞用来调控特定蛋白质的浓度和去除错误折叠蛋白质的主要机制，对于许多细胞进程，包括细胞周期、基因表达的调控、氧化应激反应等，都是必不可少的[, ]。HSP40为重要的HSP70辅助分子伴侣，HSP40虽不和BAG家族蛋白直接相互作用，但是BAG家族蛋白与HSP70、HSP40以三元复合物形式存在，促进蛋白质的重折叠[]。这些结果说明BD相互作用蛋白参与蛋白翻译、蛋白折叠、蛋白质量控制等过程，从而在维持细胞内蛋白质稳态方面发挥重要作用。
BD虽然在进化上高度保守，但不同BD的相互作用蛋白并不是完全相同的，从相互作用蛋白的数目上看，BD3和BD4最多，分别为232和242个，其次为BD5.4、BD6、BD5.3和BD1,分别为189、176、165和149个，而BD2、BD5.1和BD5.2相对较少，分别为97、81和72个(图 2b)。从相互作用蛋白的种类来看，不同BD也有其特异的相互作用蛋白，图 2c为只在某一个BD中有明显富集作用的蛋白(iBAQ比值只在一个BD pull-down实验中≥20，且鉴定到的肽段数≥2)。结果显示，不同BD有其特异性的功能各异的相互作用蛋白。我们发现HSPB分子伴侣家族的成员HSPB8,在BD3中被特异富集。有研究表明HSPB8与BAG3形成的蛋白复合物可以识别错误折叠的蛋白，招募巨噬细胞并激活自噬机制，通过自噬途径水解错误折叠的蛋白[]。我们的研究发现HSPB8与BD3的特异结合提示BD3是BAG3与HSPB8结合的区域，以及HSPB8特异性招募BAG3参与自噬途径。此外，在BD1中被特异性捕获到的TBCA为介导细胞骨架蛋白beta-tubulin正确折叠相关蛋白；在BD2中被特异性捕获到的COPE、COPA、COPB2参与细胞内Golgi-to-ER蛋白转运；在BD4中明显富集的KHDRBS1为与肿瘤发生密切相关的调控细胞周期、细胞迁移、细胞粘附蛋白；在BD6中被特异性捕获到的RFC4为与DNA复制，DNA损伤相关的蛋白。另外我们还发现，BAG5的4个BD的相互作用蛋白也各不相同。MYCBP为c-Myc结合蛋白，在BD5.2中被明显富集；MAGEA6可以增强锌指结构类型的E3泛素连接酶的活性，在BD5.3中被大量富集；而在BD5.4中被大量富集的SKP1为组成泛素连接酶SCF复合物的重要成员之一。这些结果提示，BAG5可能与E3泛素连接酶关系密切，这为今后研究BAG5的功能提供了重要的线索。总之，图 2c的结果提示我们，不同BD通过与各自特异相互作用蛋白结合，介导不同BAG家族蛋白参与特定的生物学过程。
2.3 BD相互作用蛋白功能分析
我们用DAVID在线软件对筛选出来的BD相互作用蛋白进行了GO功能分析，以P值≤0.05，且enrichment score≥2为阈值，共发现10个具明显富集的生物学过程，其中有52个蛋白参与蛋白质生物合成(protein biosynthesis)、26个蛋白参与蛋白质转运(protein transport)、22个为蛋白酶体大、小亚基(proteasome),15个蛋白具有核苷酸结合活性(nucleotide binding),其他被富集的生物学过程包括翻译调控(translation regulation)、应激反应(stress response)、糖代谢(glycolysis)、内质网-高尔基体转运(ER-golgi transport)、多功能酶(multifunctional enzyme)以及mRNA降解(mRNA decay)等(图 3a和图 3b)，这些结果提示BAG蛋白通过其BD介导的多种蛋白互作参与上述多种生物学过程。
图 3 BD相互作用蛋白GO功能富集分析
Fig. 3 The GO annotation enrichment analysis of BDs interactomes
(a)GO annotation enrichment analysis (b)Statistics analysis of GO annotation enrichment P≤0.05
2.4 BAG结构域相互作用蛋白的信号通路分析
为了更深入认识BD相互作用蛋白，我们用cytoscape软件对这些候选蛋白参与的信号通路进行了分析，图 4a和图 4b为P值≤0.05的前10个显著富集的通路。其中有17个蛋白参与泛素-蛋白酶体通路，15个蛋白与帕金森疾病相关，10个参与FGF信号通路(FGF signaling pathway)，其余的信号通路依次为EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)，Rho GTPase细胞骨架调控(Cytoskeletal regulation by Rho GTPase)，细胞周期(cell cycle)，糖代谢(Glycolysis),凋亡信号通路(Apoptosis signaling pathway)，PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)和Ras通路(Ras pathway)。综上所述，BAG家族蛋白通过其BD介导的相互作用蛋白，参与或调控上述细胞内信号通路，从而在细胞增殖、分化、存活、凋亡、肿瘤发生、发育、代谢、蛋白质合成、折叠、降解以及神精退行性疾病等过程中发挥重要作用。
图 4 BD相互作用蛋白KEGG通路富集分析
Fig. 4 The KEGG pathway enrichment analysis of BDs interactomes
(a)KEGG pathway enrichment analysis (b)Statistics analysis of KEGG pathway enrichment P≤0.05
BAG家族蛋白通过与其他蛋白形成复杂的蛋白复合物而参与多种生物学过程，包括凋亡，发育，细胞骨架重组，肿瘤发生，病毒复制，自噬等。然而人们对BAG家族蛋白发挥复杂功能的机制仍然不够了解。而蛋白质相互作用的研究是揭示其复杂机制的重要手段。蛋白结构域是介导蛋白质间相互作用的重要单元，BD是BAG家族的标志性结构域，是介导BAG蛋白与伴侣分子/其他蛋白相互作用的关键结构域，对BD相互作用蛋白的研究有助于深入认识BAG家族蛋白的生物学功能及其分子机制。本研究采用GST-BDs pull-down偶联LC/MS-MS的方法，首次将BAG家族6个成员的9个BAG结构域作为研究对象，鉴定其相互作用蛋白。我们共鉴定到了370个潜在的与BD存在直接或间接相互作用的蛋白，其中大部分从未报道。
BAG家族蛋白与HSP70蛋白相互作用在维持细胞内蛋白质稳态方面发挥重要作用。与此相一致，我们鉴定到BD相互作用蛋白，有相当一部分蛋白属于维持细胞内蛋白稳态的分子，如分子伴侣蛋白HSPA8、HSPA6、HSPA1A、DNAJA1和DNAJC9，核糖体蛋白RPL和RPS，翻译起始因子eIF1、eIF2和eIF3，翻译延长因子eEF2，泛素化-蛋白酶体相关蛋白STUB1、UBL4A、UBA和UBE等，这些蛋白是蛋白质翻译、蛋白折叠、蛋白质量控制等蛋白质稳态维持中的重要蛋白。这些蛋白在DNA修复、细胞发育调控、细胞分化、细胞周期、基因表达调控、氧化应激反应等方面发挥重要作用。研究表明，如果这些蛋白发生功能缺陷，会导致一系列与细胞内蛋白质稳态紊乱相关的疾病。例如，细胞内a-synuclein蛋白的聚集是导致神精退行性疾病帕金森症的重要原因。其特异的功能，例如BAG3在自噬、发育和细胞骨架重组等生理过程中发挥生要作用[, , ]；BAG6被认为在免疫调控、膜蛋白转运和DNA损伤修复、炎症中发挥重要作用[]。而我们的研究a-synuclein为CHIP(STUB1,E3 ubiquitin ligase)的底物，BAG5通过HSP70与CHIP发生相互作用，调节CHIP的活性而达到降解a-synuclein的目的，如果敲除CHIP或CHIP出现功能异常，将会导致a-synuclein在细胞内大量聚集[]。此外，我们还发现BAG结构域相互作用蛋白与糖代谢和细胞内多种酶促反应有关。
HSP70作为进化上保守的蛋白家族之一，普遍存在于各种生物体内，并在生物体内发挥着重要的生理功能。BAG家族蛋白与HSP70的相互作用与细胞凋亡密切相关，参与细胞凋亡信号通路的多个环节。因此，为了深入了解BD相互作用蛋白参与了哪些细胞内信号通路，我们对其进行了KEGG信号通路分析，结果显示除了与凋亡、细胞周期、神精退行性疾病相关通路被富集到以外，其他被明显富集到的通路如FGF信号通路(FGF signaling pathway)，EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)，Rho GTPase细胞骨架调控(Cytoskeletal regulation by Rho GTPase)，细胞周期(cell cycle)，PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)和Ras通路(Ras pathway)，这些信号通路在调控细胞增殖、分化、存活、死亡、肿瘤迁移侵袭等重要生理和病理过程中发挥重要作用。这些结果提示，BAG家族蛋白通过BD相互作用蛋白介导的信号通路在多种生理及病理过程中发挥重要作用。例如，BAG3在受到FGF信号通路中FGF2的刺激后，可以促进中枢神经系统的发育[]。此外我们的研究结果提示BAG蛋白可能在糖代谢方面也发挥重要作用。
另外，结果也表明不同BAG蛋白的BD有其特异的相互作用蛋白，暗示BAG家族蛋白通过与不同功能的蛋白形成蛋白复合物而发挥不同的功能。总之，我们通过GST pull-down联合质谱技术得到了比较可靠和全面的BD相互作用蛋白，这些相互作用蛋白对认识BAG家族蛋白的生物学功能及分子机制研究提供了重要线索。
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