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sds page 跑蛋白的菌液处理?（具体见说明,请勿复制）（1）6000rpm离心10min,弃上清（2）加入上样缓冲液 or loading buffer（两个是一样的?加入多少?）,100摄氏度 10min.（3）1000rpm离心2min,上清加样（加多少?0.75mm的板,）,总结,是不是菌液加的就只有上样缓冲液 or loading buffer?然后一个孔是加maker,多的加上样缓冲液 请勿复制,
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marker看你买的是什么样的,有的还是粉末状呢,那个用水溶解后也需要加loading buffer沸水浴处理的.不过现在卖的很多都是那种直接点样的.说明书一般都有说的,一般10微升.loading buffer就是上样缓冲液的英文.另外,你的实验步骤里面,你打错了,第三步是10000rpm*2min,我非常肯定这个步骤一定是高速离心.第一个步骤,我们一般取1ml菌液离心10000rpm*5min吧,具体记得不太清楚了.然后加loading buffer好像是120微升,1倍的,100微升也OK啦,然后沸水浴5到10分钟,然后高速离心,点样.为了避免串样,维持各点样孔之间的那种压力吧,具体怎么说我记不清楚了,反正就是防止别的孔的样品跑到空白泳道,很难看的.所以在空白处也点上1倍的loading buffer你按照一个固定的数字做下来,点样的时候开始要摸索一下,多点几个样,看看点多少微升合适,因为你的菌液浓度什么的我们也不知道.你要有条件,可以给蛋白定量,因为跑电泳蛋白浓度过高会很难看,浓度低了看不清楚.
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上样缓冲液 or loading buffer这个就是是一样的，收集完菌体就只加这个就行loading buffer加多少都是自己定的
看你的菌体有多少 一般你要是3 4 ml菌液离心后的菌体加30-50ul就行 你光说板的厚度了 没说梳子大小啊
一般上15-30ul吧 看你梳子了
不要上太多 梳子小的话10ul也可以看到最后我明白了
你的梳子是...
扫描下载二维码第二部分：蛋白的纯化
如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？
破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。
根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后， 菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成 的无活性的蛋白质聚集体，难溶于欤扇苡诒湫约寥缒蛩兀嗡犭业龋涫担逡簿褪俏颐浅Ｋ档牟豢扇艿鞍住６杂诤笳撸山锨搴统恋矸直鹋芤桓 PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。
对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。
沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无 论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。
包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。
电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。
包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
包涵体的纯化（一）
对于表达在包涵体内的蛋白，可以通过降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量等来使目的蛋白不表达在包涵体内达到可溶性表达。但一般用pET28作为表达质粒且蛋白表达量较大时易形成包涵体。
包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
菌体破碎一般采用： a 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施（超声时置于冰上），超声功率、超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮(5-10分钟)。 b反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 c化学处理法: 细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理.
? 必要时可将三种方法结合起来使用以使菌体充分破碎
在这我们以100 ml菌液为例：（此纯化方法可于室温中进行） 诱导表达 1 挑取含有重组质粒的菌落，接种于5 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。 2 以1％的接种量转接到100 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6－1.0，先取出300 μl诱导前的菌液，作为对照。再向锥形瓶中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养3－4 h。 3 取300μl经诱导后的菌液于EP管中，连同诱导前的菌液一起12,000 rpm离心1min后，将上清置于一个新的Eppendorf管中，细胞沉淀用等同于上清体积的ddH2O悬浮，分别制样。（以80μl样品为例，需加20μl 4×loading buffer，8μl 1M的DTT，52μl上清或沉淀悬浮液）
Ni2+亲和柱的制备 1 颠倒混匀固化的Ni2+树脂，取1ml装入层析柱。树脂自然沉降。 2 用3倍柱体积无菌水冲洗树脂。 3 用6倍柱体积1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）洗柱，放置待用（4℃）。
包涵体纯化
（参照Novagen的纯化protocol） 1 以10,000 × g 离心10 min收菌后去上清。重悬菌体于40 ml 1X Binding Buffer 。 2 超声破碎细胞至菌液应该变清亮。 3 以5,000 × g 离心15 min收集包涵体和细胞碎片。
4 去上清后重悬于20 ml 1X Binding Buffer。
5 超声破碎至悬液应该变清亮。 （在第五步之前可加溶菌酶处理或反复冻融几次以促使菌体破碎。）
6. 以5,000 × g 离心15 min后将沉淀重悬于5 ml 1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）并加蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L 。
7 放置冰上1 h 以完全溶解蛋白后以16,000 × g离心30 min去除不溶物质。并将上清在用Ni2+亲和柱纯化之前用0.45-μm 的滤膜过滤。
纯化带组氨酸的重组蛋白 1 将过滤后的样品上柱，使流速降低以使样品与Ni2+树脂充分结合。 2 再用十倍体积的1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）过柱。 3 用1X Wash Buffer（包含6 M 尿素）洗柱。至流过液A280<0.01且基本保持水平。(大约1~2h） 4 用1X Elute Buffer（包含6 M 尿素）结合的蛋白,并开始收集样品(1ml/管)，直至A280又恢复至基准线。收集的蛋白SDS-PAGE检测蛋白纯度。
纯化蛋白的透析和冻干 1 透析袋预处理：用10mmol/L NaHCO3，1mmolEDTA煮沸透析袋30min；再用ddH2O煮10min。 2 将蛋白溶液移入透析袋。 3 将其放入10倍体积以上的含3 M 尿素的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌，于4℃透析。透析液中的尿素浓度以3 M―1.5 M―0.75M―0M 递减。
4 透析完成后将蛋白质溶液离心取上清，每500μl分到一个1.5mlEP管中，于真空冻干机（MAXI Dry Lyo）中冻干。冻干的蛋白溶于PBS，SDS-PAGE检测蛋白纯度和降解程度。 5 用完的透析袋用去离子水洗净并煮沸10min，于20%乙醇中保存。
Ni2+亲和柱的后处理和重生 1 纯化完毕后，Ni2+柱用去离子水过柱1～2h，再用20%乙醇过柱1～2h。 2 为保证亲和柱的活性，可进行再生 先用下列试剂依次冲洗层析柱：2倍体积的6mol/L盐酸胍，0.2mol/L乙酸；5倍体积水；2倍体积2%SDS；1倍体积25%、50%、75%乙醇；5倍体积乙醇；1倍体积75%、50%、25%乙醇；1倍体积水；5倍体积100mmol/L EDTA；1倍体积水。再用小于2倍体积的0.1mol/L NiSO4溶液再生，用水洗，最后用平衡缓冲液平衡。
8X Binding Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9) 8X Wash Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM imidazole, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9) 4X Elute Buffer (4X = 4 M imidazole, 1 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9) 加入尿素的溶液需现配现用。此外1X Wash Buffer中的咪唑浓度为20~60 mM，在实验中可依不同情况加以调节。
包涵体复性问题注意：
在有的复性过程中有蛋白沉淀析出，有建议表示：甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用（透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果）。低分子化合物脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。此外复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/m。 复性原则 1 低浓度（可稀释后再进行透析） 2 平缓梯度（尿素浓度和pH:最适pH值范围为8.0-9.0之间） 3 低温 (温度适宜选择4℃)
包涵体纯化（二）
----（更新） 当蛋白大量表达在包涵体 且不易用NI2+柱纯化下来的时候，可以用以下的方法进行包涵体的洗涤纯化。 诱导的大肠杆菌，5000g 离心5min，收集菌体；使用超声裂解法结合反复冻融法的方法进行细菌裂解。
超声裂解法 超声破碎 缺点是发热，剪切力强烈。纯化活性蛋白的时候最好少用。
(1). 要设定好超声时间和间隙时间，一般每次超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护蛋白的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数60次 （5min）。具体的超声条件，可以自行摸索！ (2) . 一般超声用的溶液为binding buffer 10mL/g菌体湿重，超声时的溶液最好放在玻璃烧杯中 有利于散热！增大溶液体积，也有利于充分超声裂解。 (3) . 如果是表达蛋白可溶，而且菌液浓度合适时，超声后菌液应该变澄清。表达包涵体的菌液超声到液体发淡淡的白灰色即可。也可以用显微镜检测完整菌量，再决定是否再继续超声。 反复冻融法 1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2、至少3次以上冻溶。 3、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻
细菌裂解完后（最好细菌破碎比较彻底），5000g 离心15min使包涵体沉淀，去上清后进行洗涤，以除去包涵体沉淀中的杂质蛋白，洗涤时用搅拌器在4℃进行，洗涤buffer是以下三种：每步洗涤后5000g 离心15min沉淀包涵体。
Inc-A：10mL/L Triton-100； 1mM EDTA； 10g/L DOC; 50mM Tris-Cl pH 8.5;100mM NaCl
50mM Tris-Cl pH 8.5;100mM NaCl; 2MU 5mM 巯基乙醇；1mM EDTA
Inc-C: 50mM Tris-Cl pH 8.5 其中A，C可多次洗涤，次数和时间影响不是很大（我一般2-3次共30min，但是B的洗涤时间一般可根据纯化效果决定，时间越长蛋白被尿素溶解，得到的蛋白量越少，但纯度有一定上升，个人一般洗涤1h）
最后得到的包涵体用6-8M尿素溶解后跑胶观察纯度。后可使用梯度透析将尿素去除（参考蛋白纯化POTOCOL），使用蔗糖 或 PEG透析浓缩（将蛋白样品装进合适的透析袋中，埋在蔗糖或者PEG中），也可以直接免疫兔子。
所有操作于4℃进行。并在每次离心后适量加入蛋白酶抑制剂。当前位置： >>
包涵体蛋白纯化
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几 步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐 步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度 比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制 备各种酶，常选用 50-100 毫克菌体/毫升浓度，在 1KG至 10KG频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产 生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如 果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起 溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS） 、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较 厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为 1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质 量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋 白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几 次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH 范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于 20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会 引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配 60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是 10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得 100-200ml菌就够了. 但凡超声 ,我都用 60ml裂解液 ,因为我们的超声仪 ( 现代分子生物学实验技术录象里的那种) 很适合用 100ml小烧杯 ,装 60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用 4M尿素洗涤一下再用 8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可 以直接用 8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的.&取 200 微升菌液，离心后直接加上样buffer，100 度 3 分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的 包涵体? & 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？ 在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。 首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率 400W，超 5 秒，间隔 5 秒，重复 99 次。然后显微镜观察，不彻底时再重复 99 次。菌体来自 200 ml培养液，用 20 ml PBS重悬。 然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度 100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至 1 mg/ml，半小时后仍无明显 变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。 因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。 同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。 溶菌酶在pH7.4 时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经 常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细 胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。 这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。 我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。 如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？ 溶菌酶只有在pH值大于 8.0 的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌 30 分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率 400W，工作 2 秒， 间隔 2 秒，重复 199 次。菌体来自 500 ml培养物，用 30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。 哪儿的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，称取干粉 20mg。200ml菌液用 18 ml NaCl重悬，加入 2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉 加入体系，混匀，测pH降低到 5－6，加 20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。4C放置 1 小时，菌液上层变澄清，摇动发 现体系没有变粘。测pH仍在 8 左右。再 37C保温 1 小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。 另一瓶 200ml培养物，溶菌酶处理 1 小时后超声。条件：300W，超 5 秒停 5 秒，重复 99 次。菌液有变化，但很不明显。 继续超声 400 次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。 我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要？ 我的诱导物来自 1：20 过夜培养物接种，37C生长 3 小时后 30C诱导 2 小时（0.8mM IPTG） 。 是否菌液太浓， Pharmacia的说明书 200 ml培养物用 10 ml重悬， 我用 20 ml， 仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些， 200 ml用 30－40 ml重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细 胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法： 1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。 2 化学裂解的方法：10g酵母 加 1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评） 3 尿素裂解液（尿素 8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值 8.0）高压匀浆。 （这个好象 也该在方法 2 中） 4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。 5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体 酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。 我用过化学裂解的方法，10g酵母 加 1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素 8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值 8.0） ，据说效果 可以 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白 活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每 次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时 是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。5、如何鉴定细菌超声破碎的程度 最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色 0.5 分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的DNaseI 不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。 另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。 我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种 酶都是用活性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。 其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16 度或 37 度） 。7、超声裂解细菌是否完全？ 最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色 0.5 分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色 二、包涵体的洗涤 1、包涵体的洗涤问题 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用 6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质， 注意留样跑电泳，然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找 到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每 次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是 你要的，那就不用管了。2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、 质粒ＤＮＡ和其它杂质。 洗涤常用 1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40 等加EDTA和还原剂 2-巯基苏糖醇（DTT） 、β-巯基乙醇等反复多次进行，因 去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加 50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达 50% 以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不 溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为 0.1-5mM。EDTA为 0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa) 在 4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂， 易经透析和超滤除去。 它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用， 所需浓度尿素 8-10M， 盐酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为 70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸 盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量 蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉 淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的 效果也不错，通常是一步就能达到纯度为 95%以上的包涵体。 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在 4 度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感 觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少 4 度（呵呵，不好意思！ ） 。不过我接 着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！三、关于包涵体的溶解： 1、 请教GST包涵体溶解 直接用 8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。 （由于快速稀释相当于复性过程，产物 用于检测没有问题的） 我所用的包涵体提取方法： 1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮 ２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清 ３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次 ４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml 溶解，室温静置３０分钟至２小时 ５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清 ６．加２０％ＰＥＧ４０００ ２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM, ２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢加 100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜） ７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用 ！Buffer A配方： Tris-base 50mM EDTA 0.5mM NaCl 50mM 甘油 5%DTT 5mM2、包涵体的溶解 十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者 的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了 3、有关包涵体的溶解问题强的变性剂如尿素（6-8M） 、盐酸胍（GdnHCl 6M） ，是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各 种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体 溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基 三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱 氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、 二硫基苏糖醇（DTT） 、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是 必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存? 我在 4 度放了半个月，目前没出什么问题 5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题? BI溶液在室温放置 48 小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理 BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。 6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？ GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的 GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？做完裂解之后加TritonX－100 轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！四、包涵体的复性 1、包涵体如何复性 包涵体的复性主要有两种方式： 1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释 2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂 其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的 2 硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。 还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！ 另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次 你家了多少蛋白呀 ？蛋白量过大也会使复性困难。 你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！ 最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了~~ 包涵体的复性还要注意以下几点：1.首先要获得较高纯度的包涵体。 2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。 3.透析前后均要离心 4.透析不能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索。 小技巧： 1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100. 2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性 3）复性液的组成很有讲究，本人使用 L-Arginine-Hydrochloride 12-24h 4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析 12-24h 5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解） 6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于 0.5% Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还 加 入 一 定 的吧，忘了。 我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可 以在上柱前已经只剩下 3-4 条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。 这段文字可以参考： 用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质， 细胞质和包涵体中的分布。 渗透休克 用 1.2.3 方法诱导细菌（10ml体积） ，测菌液OD600，10000 r/min离心 0.5 min去上清，加入渗透休克溶液 1 （V1= OD 600×V2/5，V1 为渗透休克溶液 1，V2 为培养新鲜菌液） ，冰浴 10 min，10000 r/min离心 0.5 min，去上清。 加V1 体积渗透休克溶液 2 重悬，摇动冰浴 10 min，10000 r/min离心 0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上 清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加 1/10 体积 100% TCA (w/v)，涡漩 15 sec.，冰浴 10 min，13000 r/min 离心 5 min， 100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥 1 h， 加V1/2 体积 1× PBS （pH 10） 溶解， -20℃保存， 取 10 ul加入等体积 2×SB， 进行 12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。 超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加 1/10 培养体积 20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20% 工作选择，脉冲粉碎 1 min，然后 13000 r/min离心 5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。 沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌 100×OD600/3 ul体积加 1% SDS溶解，加等体积 2×SB，进 行 12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30 占细菌总蛋白的相对含量。 1.2.7 重组融合蛋白的纯化 PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3） ，TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至 OD600 约为 1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度 1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集 菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。 或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer， 最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加 50%酒精保存，以免长菌。 洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后 12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。3、包涵体复性 2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。 另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。 对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试 4 度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少 包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我 的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了 1%的甘氨酸和 5%的甘油，有一定的助溶效果。我 想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过 程，不同蛋白的复性条件也各不相同。 5、包涵体复性问题 包含体复性三大原则： 1。低浓度 2。平缓梯度 3。低温有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。 此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵体复性形成聚集物 关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶 解了，但活性不高或没有也不行呀！7、复性中蛋白析出！ 出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液 成分，每隔 1 个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确 折叠。但是复性的比率应该很低。 若加变性剂尿素可加到 2M，盐酸胍可加到 1-1.5M； 另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。 8、包涵体复性液配方 对于包涵体复性，一般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从 4M开始，到 1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的 缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题： 1）最适pH值范围为 8.0-9.0 之间； 2) 温度适宜选择 4℃； 3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为 0.1-0.2mg/mL； 4) 复性时间一般为 24-36 小时； 5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度 下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。 还有就是你的蛋白质的特性 9、什么叫复性成功 复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺 电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况 的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同， 4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不 同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉 淀析出。 6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命 活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体 有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制 尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中 发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用 等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及 相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。 另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！点击浏览该文件10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透 析后用GSH sepharose 4B纯化， 结果得到了比较纯的融合蛋白， 这是否说明GST的活性已得到恢复 （因为能与GSH结合） ， 请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶 活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用 GSH sepharose 4B 纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的 GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？答：1） 。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也 可以与这小段AA 对应的抗体结合。2） 。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇 也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做 单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干 什么。3） 。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考 虑。 4） GST为 26kd,你得到的蛋白活性应通过 目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体 纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化， 去掉抗GST抗体， 如果你的目的蛋白很大， 可以凝血酶切割除去 Ｇ ＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小 分子，没影响。 5） 既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看 你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。 不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。 变性的融合蛋白做抗原是没有影响的， gst的分子量是 26kda， 当然， 如果将融合伴侣除去， 抗体的特异性会要更好一些， 如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是 缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。 6） 做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST 挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些 另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀五、包涵体的纯化 复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。 （注：当然也可以先纯化然后再复性―――一般多采 用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行―――比如柱上复性。 ）六、综述以及其他 1、蛋白复性和纯化在线资料 1. 包涵体表达的蛋白的复性 http://www.sinobio.net/method/ecoli.htm#1 2. 重组蛋白纯化方法 组织细胞的破碎 http://www.sinobio.net/method/sansheng/dissociation.htm 目标蛋白的粗提 http://www.sinobio.net/method/sansheng/extracting.htm蛋白质沉淀方法 http://www.sinobio.net/method/sansheng/precipitation.htm 色谱分离 http://www.sinobio.net/method/sansheng/chromatogram.htm2、综述 蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体的组成与特性： 一般含有 50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质 粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子， 或环境不适， 无法形成正确的次级键等原因形成的。1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以 至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度 等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵 体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎分离： 1、离心：g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性 剂如 2M尿素在 50mM TrispH7.0-8.5 左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋 白。溶解： 常用的变性剂有尿素（8M） 、盐酸胍（GdnHCl6-8M） ，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。 其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的 去除而不允许在制药过程中使用。极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH&9.0 溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可 以溶解在 60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。 有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37 度 1 小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM2-BME或DTT，也有文献使 用 5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用 5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二 硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原 剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一 般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到 2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从 4M开始，到 1.5M 时复性过程已 经结束。复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模 操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白 可能在超滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行 的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。还原剂的去除： 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所 必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。常用的氧化方法有： 空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。 氧化还原电对（redox） ：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非 常容易复性，如牛胰RNA酶有 12 对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到 95%以上，而有一些蛋白至今没有发 现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在 20%左 右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、 共溶剂和其他添加剂的存在与否等。复性过程的添加剂： 1、共溶剂：如PEG，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接 触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在 0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI） ：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的 结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作 用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。 3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP） ，是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子 伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到 2 和 3 的应用的例子。 4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。 5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。 6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。 7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱 有SEC、HIC、IEC、IMAC等。当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套 用。复性时的蛋白浓度： 一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很 容易变性。复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺 电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况 的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。 4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不 同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉 淀析出。6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。几个复性的实例： 1、MHCII JBC 269（47） ：1994 增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037 度 1hr. 复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein. 2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5. 复性：10 倍稀释到 10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液 密闭透析 16hr，开口透析 8hr，对 150mMNaCl,10mM Tris pH8.0 透析 48hr。 3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。 增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml. 复性：稀释到 100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对 4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析 3 次，温度 4 度。纯化： 一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后 复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond&5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐， 更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。 当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精 制创造条件。 从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提 高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体的组成与特性： 一般含有 50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质 粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子， 或环境不适， 无法形成正确的次级键等原因形成的。1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以 至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度 等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵 体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎分离： 1、离心：g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法：洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性 剂如 2M尿素在 50mM Tris pH7.0-8.5 左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。溶解： 常用的变性剂有尿素（8M） 、盐酸胍（GdnHCl 6-8M） ，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。 其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的 去除而不允许在制药过程中使用。 极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH&9.0 溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可 以溶解在 60mM HCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。 有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37 度 1 小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使 用 5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用 5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二 硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原 剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一 般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从 4M开始，到 1.5M 时复性过程已 经结束。 复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模 操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白 可能在超滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。还原剂的去除： 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所 必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。常用的氧化方法有： 空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。 氧化还原电对（redox） ：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原 剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mM GSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非 常容易复性，如牛胰RNA酶有 12 对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到 95%以上，而有一些蛋白至今没有发 现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在 20%左 右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、 共溶剂和其他添加剂的存在与否等。复性过程的添加剂： 1、共溶剂：如PEG，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接 触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在 0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI） ：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的 结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作 用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。 3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP） ，是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子 伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到 2 和 3 的应用的例子。 4、0.4-0.6M L-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。 5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。 6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。 7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱 有SEC、HIC、IEC、IMAC等。 当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套 用。复性时的蛋白浓度： 一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很 容易变性。复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况 的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同， 4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不 同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉 淀析出。 6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。几个复性的实例： 1、MHCII JBC 269（47） ：1994 增溶：16-40mg Protein,8M GdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.0 37 度 1hr. 复性：8-16fold dilution to 1-5mg/ml Protein. 2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mM Glucine pH8.5. 复性：10 倍稀释到 10mM DTT,2mM DodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mM NaCl,10mM Tris pH8.0.对起始缓冲液 密闭透析 16hr，开口透析 8hr，对 150mM NaCl,10mM Tris pH8.0 透析 48hr。 3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。 增溶：7M GdnHCl,10mM Tris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml. 复性：稀释到 100mM Na2HPO4,2mM EDTA,0.1%PEG,0-4M GdnHCl,0.1mM GSSG,0.2mM GSH,pH7.4,0.025mg/ml Protein.RT 24hr.对 4L 25mM sodium phosphate,2mM EDTA,0.1% PEG,pH7.4 透析 3 次，温度 4 度。纯化： 一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后 复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond&5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐， 更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。 当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精 制创造条件。 从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可以接受的工艺一般要经过两到三次柱纯化，工艺越 简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯 化。蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体的组成与特性： 一般含有 50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子， 或环境不适， 无法形成正确的次级键等原因形成的。1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以 至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度 等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵 体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎分离： 1、离心：g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法：洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性 剂如 2M尿素在 50mM TrispH7.0-8.5 左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋 白。溶解： 常用的变性剂有尿素（8M） 、盐酸胍（GdnHCl6-8M） ，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。 其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的 去除而不允许在制药过程中使用。极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH&9.0 溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可 以溶解在 60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。 有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37 度 1 小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM2-BME或DTT，也有文献使 用 5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用 5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二 硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原 剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一 般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到 2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从 4M开始，到 1.5M 时复性过程已 经结束。复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模 操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白 可能在超滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行 的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。还原剂的去除： 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所 必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。常用的氧化方法有： 空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。 氧化还原电对（redox） ：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原 剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非 常容易复性，如牛胰RNA酶有 12 对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到 95%以上，而有一些蛋白至今没有发 现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在 20%左 右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、 共溶剂和其他添加剂的存在与否等。复性过程的添加剂： 1、共溶剂：如PEG，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接 触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在 0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI） ：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的 结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作 用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP） ，是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子 伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到 2 和 3 的应用的例子。 4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。 5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。 6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。 7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱 有SEC、HIC、IEC、IMAC等。当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套 用。复性时的蛋白浓度： 一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很 容易变性。复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺 电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况 的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。 4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不 同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉 淀析出。 6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。几个复性的实例： 1、MHCII JBC 269（47） ：1994 增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037 度 1hr. 复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein. 2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5. 复性：10 倍稀释到 10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液 密闭透析 16hr，开口透析 8hr，对 150mMNaCl,10mM Tris pH8.0 透析 48hr。 3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。 增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml. 复性：稀释到 100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对 4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析 3 次，温度 4 度。纯化：一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后 复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond&5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐， 更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。 当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精 制创造条件。 从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提 高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性 的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的 重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。 关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有 4000 多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占 90%以上，尽管基因重组技术为大 规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径， 然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难， 即这些蛋白质在E.coli中绝大 多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约 0.1~3.0μm的 固体颗粒[1]。 自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来， 人们就一直期望得到高活性、 高产量的重组蛋白。 不可溶、 无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋 白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体 外成功复性。包涵体形成的原因重组蛋白在宿主系统中高水平表达时， 无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系， 都会形成包涵体[2]。 主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次 级键等原因形成的[3]。1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以 至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵 体沉淀。5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。减少包涵体形成的策略1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形 成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌 到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组 蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达） 、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的 还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。包涵体的分离及溶解对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对 重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效 的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后 g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包 涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100 或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白， 这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如 8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢 键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶 几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如 70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增 溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开 蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同 时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。蛋白质的折叠机理包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学 稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大 量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争 [1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋 白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的 具体步骤可用下式描述[12、13、14]：伸展态→中间体→后期中间体→天然态↓聚集体在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一 个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种 疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性 过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间 等因素的影响。提高重组蛋白质折叠复性的方法一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白 质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且 难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理 量太大，不利于工业放大[16]。2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变 性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚 集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变 性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进 后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有 效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改 变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、 共溶剂：如PEG，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减 少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用， 但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如 GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的 二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可 能为： 稳定蛋白的活性状态、 降低非正确折叠的稳定性、 增加折叠中间体的稳定性、 增加解折叠状态的稳定性。 e、 0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度 地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构 象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白 质[20]。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质 的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。g、人工 伴侣[21]：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复 合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。h、单克隆抗体[22]： 待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。I其它：多聚离子化合物如肝 素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复 性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的 降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。jklmn4、 液相色谱（LC）复性法：液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手 段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）[23]、离子交换色谱（IEC）[24]、凝胶排阻色谱（SEC）[25]、亲和色谱（AFC） [26]已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：在进样后可很快的除去 变性剂；由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子 聚集，从而避免了}