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人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进
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　　【摘要】本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）的方法，为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Percoll分离液（1.073g/ml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC，应用贴壁筛选法传代培养，流式细胞仪检测细胞表面抗原，成骨诱导体系（地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化，通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定。结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC，稳定表达CD73、CD105、CD166，不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性，脂肪细胞内出现明显的脂滴。结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化，能够从成人骨髓液中分离出MSC，并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定。本操作方案具有一定的临床应用价值。
　　【关键词】间充质干细胞
　　间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）是最早自骨髓中分离出的一类具有自我更新及多向分化潜能的组织干细胞［1］。作为多种骨髓基质细胞的祖细胞，MSC具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应［2］。MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移植中的干细胞数量相对不足及减少移植物抗宿主病提供了一个有效途径［3，4］。本研究旨在建立一种从成人骨髓组织中分离、培养、扩增MSC的简便易行的方法，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原和定向诱导分化，完成对获得细胞的初步鉴定，为干细胞移植的临床治疗及组织损伤修复工程提供实验基础。
　　材料和方法
　　材料与试剂骨髓穿刺液5ml取自于健康成人移植供者，肝素抗凝，4℃保存。分离培养试剂：Percoll细胞分离液（1.073g/ml，Pharmacia产品），MSC专用培养基MesenCultTM（MSCbasalmediumandmesenchymalstemcellstimulatorysupplements，Stemcell产品）和胎牛血清（FBS，Stemcell产品），低糖及高糖DMEM培养基（Dulbecco′smodifiedEaglemedium，GibcoBRL产品），胰蛋白酶（Sigma产品）；诱导试剂：地塞米松（dexamethasone）、β-甘油磷酸钠（β-glycerol-2-phosphatedisodiumsalt）、抗坏血酸磷酸盐（ascorbicacid-2-phosphatesalt）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰岛素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒均为Sigma产品；流式相关抗体：鼠抗人单克隆抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BDPharMigen产品）、CD105-FITC（SEROTEC产品）。主要仪器：细胞培养板、细胞培养瓶（Corning）；超净工作台（广州医学生物工程研究所，GX-Ⅱ型），细胞培养箱（WTCbinder），流式细胞仪（FACSCalibur，BectonDickinson产品），倒置显微镜、照相机（Olympus），荧光显微镜、数码相机（Nikon），低温冷冻离心机（IECcentra）。医学教育网搜集整理
　　方法人骨髓MSC的分离培养与传代无菌条件下用等量PBS稀释肝素抗凝骨髓液，在10ml消毒离心管中加入6mlPercoll分离液，再将4ml稀释的骨髓液小心加至分离液表面，820×g离心20分钟；吸取分界面的白色絮状细胞层，用低糖DMEM培养基混匀，300×g离心10分钟，洗涤2次。按2×105/cm2密度接种于含MSC专用培养基的75cm2培养瓶，37℃、5%CO2培养箱全湿条件下培养48小时，全量换液，去除血细胞及其它未贴壁成分。用含10％FBS的低糖DMEM培养基维持培养。根据细胞生长情况，每3天全量换液。细胞融合达80％以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5ml消化，按1∶4或1∶5传代。取3代以上的细胞进行实验。
　　MSC表面抗原的检测取第3代生长达80%融合的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，计数后取2×106个细胞，分装6管，每管加入10μl荧光标记抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另设1管为空白对照，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；加入200μlPBS混匀细胞，并以1%多聚甲醛固定，4℃保存，24小时内上流式细胞仪检测。
　　定向诱导MSC向成骨细胞分化的方法与鉴定收集消化后细胞，按3000cells/cm2接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含10％FBS的高糖DMEM培养液，加入成骨诱导体系：地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L，每3天全量换液，维持2-3周。用碱性磷酸酶试剂盒染色。
　　定向诱导MSC向脂肪细胞分化的方法与鉴定收集消化后细胞，按1×104cells/cm2接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含10％FBS的高糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系：地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5mg/L（或10mg/L）、IBMX0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L（或200μmol/L），每3天全量换液，维持2周。镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况，油红O染色。随机选择10个非重复视野，计数脂肪细胞阳性率，结果用均数±标准差（X±D）表示。
　　形态学观察Percoll分离液分离获得的细胞呈圆形，接种48小时全量换液后，可见少量长梭形贴壁细胞，周围有明亮的圆形细胞存在。随着培养时间延长，贴壁细胞迅速增多，呈漩涡状生长，细胞变得细长而有突起，其间散在分布的细小黑色颗粒可能为粘附性强的血细胞，胰蛋白酶消化传代后逐渐消失。原代培养的MSC约15天长满，传代后约5-7天可达80％融合。连续培养12代，细胞生长情况无明显差异，但继续培养至15代，细胞生长速度明显减慢，细胞变大，形状不规则，胞内颗粒增多。
　　流式细胞仪表型分析获得的MSC均质性好，高表达间质细胞标记CD73（98.6％）、CD105（97.7％）、CD166（97.4％），不表达造血细胞标记CD45（0.2％）、CD34（0.4％）。
　　ALP染色加入成骨诱导体系后约1周，可见细胞基质出现结节样钙沉积，至2-3周明显增多，碱性磷酸酶染色强阳性；对照组细胞以未加诱导剂的含10％FBS的高糖-DMEM培养液培养，染色呈阴性。
　　油红染色加入脂肪诱导体系后约2-3天，个别细胞内就出现微小明亮的脂肪滴，聚集在细胞一侧。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，脂滴明显增大并发生融合，细胞也变成方形或角形，体积变大。培养至2周，融合的脂肪滴几乎充满整个细胞，油红染色呈明亮的橙红色。采用5mg/L胰岛素和60μmol/L消炎痛诱导，出现脂滴的时间早于10mg/L胰岛素和200μmol/L消炎痛诱导，脂肪细胞阳性率（90.5%±4.5%）大于后者（70.5%±5.5%）。
　　本研究中从新鲜人骨髓穿刺液中分离获得的骨髓基质细胞具有MSC的一般生物学特性：细胞为典型的成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长，体外扩增至12代，细胞形态不发生明显改变，高表达间质细胞标记CD73（SH3，4）、CD105（SH2）、CD166，不表达造血细胞标记CD34、CD45。在适宜的诱导条件下，MSC能够较为容易地分化为成骨细胞及脂肪细胞，且具有多向分化能力。由此，建立了从新鲜成人骨髓液分离培养、初步鉴定MSC的实验方案。
　　MSC在骨髓有核细胞中含量相对稀少，约为1/105［5］，随着年龄增长，骨髓中MSC的数量及增殖分化能力均显著下降［6］。成人骨髓中还存在着造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等多种细胞成分，因此，必须找到合适的分离方法以获得纯度较高且数量较多的细胞产品，以满足临床需要。目前较为常用的方法有：根据MSC低密度特性采用密度梯度离心法；利用MSC与培养底物的粘附性采用贴壁筛选法；根据细胞大小和表面标记采用免疫磁珠或流式细胞分选法。贴壁法直接接种骨髓细胞，在培养过程中不断换液，去除非贴壁细胞，最终得到富集的MSC，但纯度较低；分选法得到的MSC纯度较高，但细胞活率受影响，而且费用昂贵。采用1.073g/mlPercoll分离液进行密度梯度离心并结合定期全量换液的贴壁筛选法，培养出的MSC纯度提高。细胞接种和传代密度对细胞的生长速度和分化状态有一定影响，尤其是原代培养的人体细胞。本实验采用2×105/cm2的密度接种细胞，48小时全量换液。传代时按照1∶4或1∶5扩增，细胞密度没有严格限制，消化时将0.25％的胰蛋白酶稀释为0.10％-0.15％，并尽量缩短作用时间，减少对细胞的刺激。这样处理的细胞生长良好，多次传代不会影响生物学特性。
　　体外研究发现，MSC具有多能分化的潜能，经诱导可分化为不同的结缔组织细胞，并把这一现象作为判断MSC自我更新和多向分化能力的指标之一。利用MSC易于分离扩增、表型稳定的生物学特性，可将其作为研究多能干细胞定向分化调控机制的理想模型。已发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员ERK、JNK、p38的特异性抑制剂能够增强脂肪生成转录因子C/EBPα、β及过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR-γ）的表达，促进MSC向脂肪分化，同时抑制成骨分化［7］；骨髓基质祖细胞在向成骨和脂肪细胞分化之间存在某种平衡，ERK可能是体内决定MSC分化方向的开关［8］。本实验联合应用地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、胰岛素、消炎痛、IBMX，诱导人骨髓MSC向成骨细胞及脂肪细胞分化。β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐可为成骨细胞的形成提供磷元素，并促进钙盐沉积；地塞米松激活糖皮质激素受体，促进C/EBPs生成，同时降低脂肪细胞分化抑制因子pref-1的表达；胰岛素与IGF-1、IRS等受体结合，激活Akt，Ras，ERK1/ERK2等信号传导通路；消炎痛为非类固醇抗炎剂，是PPAR-γ的配体；IBMX提高细胞内cAMP水平，激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB），调控C/EBP（的表达，诱导PPAR-γ和C/EBPα产生，参与脂肪细胞的早期生成［9，10］。结果还显示，低剂量胰岛素和消炎痛诱导MSC分化为脂肪细胞的阳性率更高，提示这两种药物在高浓度时可能存在一定的拮抗效应，胰岛素促进ERK的活化可能导致PPAR-γ磷酸化而降低其转录活性，部分抵消了消炎痛的作用，但该结果有待重复实验加以证实。医学教育网搜集整理
　　骨髓中存在着造血组织和非造血组织两种成分，机体内正常造血功能的维持依赖于造血干细胞的自我更新和造血微环境的完整与稳定。MSC作为多种骨髓基质细胞的前体细胞，参与造血微环境的稳态调控，并为机体新陈代谢及组织损伤修复提供“库存”细胞，在干细胞移植和组织工程中具有广泛的应用前景。本研究初步建立了从成人骨髓穿刺液中获得和鉴定MSC的实验方案，具有操作简单、便于掌握、实验周期较短等特点，适于在临床实验室推广应用，为今后MSC更好地进行临床治疗打下基础。
　　参考文献
　　1　Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res，1991； 9： 641-650
　　2　Devine SM，Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Curr Opin Hematol，2000； 7： 358-363
　　3　Maitra B，Szekely E，Gjini K，et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Transplant，2004； 33： 597-604
　　4　Le-Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet，2004； 363（9419）：
　　5　Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human Mesenchymal stem cells. Science，1999； 284（5411）： 143-147
　　6　Rao MS，Mattson MP. Stem cells and aging： expanding the possibilities. Mech Ageing Dev，2001； 122： 713-734
　　7　Tominaga S，Yamaguchi T，Takahashi S，et al. Negative regulation of adipogenesis from human mesenchymal stem cells by Jun N-terminal kinase. Biochem Biophys Res Commun，2005； 326： 499-504
　　8　Jaiswal RK，Jaiswal N，Bruder SP，et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem，2000； 275：
　　9　Nuttall ME，Gimble JM. Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol，2004； 4： 290-294
　　10　Rosen ED，Walkey CJ，Puigserver P，et al. Transcriptional regulation of adipogenesis.Genes Dev，93-1307
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　|　　|　　|　CM-DiI示踪人脐血源基质细胞体内迁移定位的研究
0引言造血功能障碍是恶性肿瘤化学药物治疗和大剂量放射线治疗、放射源意外泄漏和核战争条件下急性放射损伤的主要并发症之一。目前,有关造血功能障碍的研究主要集中在造血实质细胞,有关造血微环境在造血调控中的研究相对有限。造血微环境是造血干细胞定居、增殖、分化、发育和成熟的场所,基质细胞是造血微环境的主要成分[1]。研究发现,经大剂量放射线治疗和化疗药物预处理的患者,其骨髓基质细胞支持造血细胞增生的能力均低于正常对照组[2]。因此,从改造造血微环境入手解决造血功能损伤,值得探讨。本课题组长期从事人脐血源基质细胞(hu-m an umb ilical cord b lood-derived strom al cells,hUCBDSC)及脐血造血微环境的研究[3,4],发现并证实人脐血中存在基质细胞的前体细胞,能通过特定的细胞因子组合使hUCBDSC得以有效扩增;扩增后的hUCBDSC具备造血基质细胞的基本特征和造血调控功能的物质基础,可促...&
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0引言研究骨髓干细胞移植疗效,需要对移植细胞在体内的存活、迁移、分布及增殖进行监测。为区别供体及受体细胞,需要有效的标记方法对这些细胞进行标记。常用的标记有免疫组织化学、荧光染料、放射性同位素标记及磁性标记等[1]。荧光标记直观简单,但检测时需处死实验动物制备组织切片,不适合活体示踪及临床应用。放射性同位素标记的优点是背景信号低,信噪比高,但示踪时间极短,空间分辨力差。磁共振具有很高的空间分辨率、可以进行整体成像。超顺磁性氧化铁(superparamagneticNo ReAc用SPIO标记移植细胞,可以用磁共振活体示踪移植细胞[2-3]。CM-DiI是一种荧光染料,无细胞毒性,不影响细胞的生长,适合标记和示踪细胞[4]。本文用SPIO及CM-DiI双标记骨髓间充质干细胞,希望建立一种不但直观简单,而且能活体示踪移植细胞的标记方法。1材料和方法设计:细胞学体外观察。时间及地点:于在昆明医学院完成。材料:健康中...&
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0引言脂肪干细胞是存在于脂肪组织中的间充质干细胞,具有多向分化的潜能。该细胞由Zuk等[1]于2001年首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得。脂肪干细胞的增殖能力和多向分化潜能使其有可能作为种子细胞用于细胞治疗和组织工程修复。它的用途非常广泛,可用于细胞替代治疗、基因治疗、组织工程等,涉及到医学的多个领域,现已应用于临床前期体内移植实验[2-6]。在体内实验中,为研究干细胞移植疗效,移植前对干细胞进行有效标记是移植后检测、识别移植细胞,了解移植细胞在体内存活、迁移、分布、增殖、分化、转归和判断疗效的必要前提。本实验应用胶原酶消化法分离大鼠脂肪干细胞,用荧光活性染料CM-DiI标记脂肪干细胞,检测其标记效率及细胞毒性。1材料和方法设计:细胞学体外观察。时间及地点:在解放军沈阳军区总医院全军神经外科中心实验室(国家级)完成。材料:实验动物:清洁级6周龄雄性SD大鼠8只,体质量150g,由解放军沈阳军区总医...&
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0引言Introduction骨髓间充质干细胞占骨髓有核细胞的百万分之一到十万分之一,故分离高纯度并能良好生长和增殖的骨髓间充质干细胞是原代培养的关键性技术。目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法[1]。常用从骨髓细胞中分离骨髓间充质干细胞的方法主要有:全骨髓贴壁分离法、密度梯度离心法、红细胞溶解法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法等[2-6],而目前最常用的培养骨髓间充质干细胞的方法是全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法。1材料和方法Materials and methods设计:细胞学体外实验。时间及地点:实验于月在昆明医科大学第一附属医院细胞培养实验室完成。材料:实验动物:1月龄雄性SPF级SD大鼠4只,体质量50-100 g,由昆明医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准[7]。实验方法:全骨髓贴壁分...&
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种子细胞是组织工程骨的重要组成部分,BMSC是一种比较理想的骨组织工程种子细胞,体外二维培养已不能满足研究的需要,与支架材料三维共培养构建组织工程骨已日益成为研究热点。但目前还未有较好的体内外源性细胞的示踪方法。而具有生物活性的荧光染料可作为示踪剂在激发光下显示细胞形态,并可显示细胞与支架材料植入体内后较长时间的细胞生长分布情况。CM-DiI(1,1'-d ioctadecyl-3,3,3',3'-tetram-ethylindocarbocyanine perchlorate)是一种荧光活性染料。研究显示,CM-DiI无细胞毒性,不影响细胞的生长,在549 nm激发光下可产生发射波长为565 nm的红色荧光[1]。本研究主要观察CM-DiI对犬BMSCs体外生长增殖、成骨分化的影响,以及标记后的BMSCs与支架材料复合共培养植入体内,在皮下异位成骨部位示踪BMSCs的生物学转归情况及对体内成骨的影响。1材料与方法1.1实验动物...&
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作者：ThermoFisher
来源：ThermoFisher
关键词：脐带血,干细胞,冻存
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是指中胚层来源的具有多方向分化潜能的一类多能型干细胞的统称。早期研究中MSC通常特指骨髓来源的一类混合有间充质干细胞的基质细胞，也称为骨髓基质细胞（Marrow stromal cell）。随着研究的进展，MSC的来源不断扩展，分离的纯度不断提高，骨髓、脐带、脂肪、牙髓等组织都成为了间充质的重要来源。
间充质干细胞之所以称为干细胞临床研究中极为受重视的一类（胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞和神经共四类），与其自身的特点息息相关：
1．来源丰富
2．制备简单
4．低免疫源性和致瘤性
骨髓基质细胞在研究成为热点之前就是研究重要的靶点细胞，各类三维人工骨采用的细胞通常就是骨髓基质细胞，在很多已软骨为主的人工关节中也有应用，最重要的原因就是获得相对容易。从骨髓中提取的细胞经过淋巴细胞分离液的富集，位于中间的单核细胞层就是骨髓基质细胞。
经过培养和进一步纯化的间充质干细胞通常具有CD49a，CD90和CD105表面抗原阳性，但是由于来源复杂，通常不作为主要的检测标准，相对较为常用的是研究者一般公认的诱导分化标准：间充质干细胞一定具有向脂肪细胞，成骨细胞和成软骨细胞这三大方向的分化能力，从另一角度看这也说明了间充质具有的多向分化潜能，至少对于大多数种类中胚层来源的组织，MSC有明显修复能力。
间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，这两类细胞都具有MSC共同的特点低免疫源性，特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单，除了主要的大血管，其余均以结缔组织为主，造成了脐带间充质干细胞基本未与抗原接触，所以免疫源性很低。无论是骨髓间充质干细胞还是脐带间充质在目前的临床研究中异体移植时均不需要配型，受体也无明显的排异反应，这极大的增加了临床应用的可能性。
在目前可以追踪的临床病例研究中，间充质干细胞移植没有可以判定的有直接联系的成瘤报道，这相对于胚胎干细胞的临床应用有明显的改善，也是间充质干细胞移植治疗逐渐成为治疗临床应用研究主要方向的重要原因。
间充质对于受体的治疗作用可能有以下两方面原因：MSC对于受损部位组织的定向分化和MSC细胞因子的旁分泌作用：
目前常见的MSC临床应用研究的主要方向包括：
股骨头坏死
关节软骨损伤
神经退行性疾病：帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症
重症肌无力
间充质制备流程
(责任编辑：jiyehui)
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IL-35修饰的间充质干细胞免疫调节性能初探.pdf 68页
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IL-35修饰的间充质干细胞免疫调节性能初探
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得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不
包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志
对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
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天津医科大学硕士学位论文
本实验通过分离大鼠间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs ），使用
携带IL-35 基因片段的表达载体转染MSCs 细胞，在体外建立MSCs 与DC 、T
细胞共培养体系，探讨修饰后的MSCs 的免疫调节作用。
(1) 无菌条件下分离Sprague-Dawley
（SD）大鼠股骨和胫骨，使用全骨髓贴
壁法培养MSCs ，胰酶消化传代培养。待培养至第3 代时进行流式检测，鉴定分
离的MSCs 体外分化的潜能。(2)
使用LPS 处理3 天的人外周血单核细胞cDNA
为模板，扩增获得EBi3 和p35 基因片段，再通过重叠PCR 方法，人工合成了IL-35
片段，将其克隆进真核表达载体 pMSCV-IRES-GFP
中，提取质粒后瞬时转染
MSCs ，Real-time PCR 检测修饰后的MSCs 基因表达情况，ELISA 检测细胞上清
中IL-10、TGF-β1、IL-12 的分泌情况。(3)
密度梯度离心法分离培养Wistar
鼠骨髓未成熟DC 细胞，建立修饰后的MSCs 与DC 细胞的体外共培养体系，分
为直接接触组和间接接触组，流式检测共培养48 小时后DC 表型的变化，ELISA
检测DC 细胞分泌IL-12 的变化情况。(4)
建立修饰后的MSCs 与脾脏T 细胞的
体外共培养体系，分为直接接触组和间接接触组，流式检测CD8+ T 细胞和CD4+
调节T 细胞（Tregs ）水平，MTS 检测T 细胞增殖，Real-time PCR 检测与
T 细胞共培养后MSCs 的IL-10 和TGF-β 基因表达情况。
(1) 使用全骨髓贴壁法培养的MSCs 成细长梭形状，形似成纤维细胞，排列
均匀，成漩涡状生长，流式检测其高表达CD29、CD44 和CD90 分子，分别为
84.12%、90.77%、97.27%，而几乎不表达造血系的CD34 和 CD45
分子，分别
为 1.87%、1.06%。证实所获得的MSCs 为典型的间充质干细胞，第三代MSCs
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