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从cnnci删除列表里提取双拼的算法又得到改进
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从前几天的某一天，共23万个域名，提取了如下的长得很像是双拼的。
我使用的算法是“正则”
列表如下：
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这不是typo吗
支持楼主做一个在删除域名里找typo的工具
埋头翻贴学习中
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没必要贴出那么多域名吧
拖得浏览器打颤
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我自己一直用程序把cnnic删除列表分成NNNN、CVCV、双拼、三拼、四声母、杂米等等并生成Excel，几十万的域名，应该几分钟内就搞掂了。
叹世界、探世界<
游艇节、《游艇界》<
医研社、译研社<
新闻+，新闻家<
词立方、瓷立方<
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顺便吧收录和pr一直搞出来就完美了
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很容易算双拼的
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论坛管理员邮箱：猪肌注氟苯尼考的药动学-药效学研究_甜梦文库
猪肌注氟苯尼考的药动学-药效学研究
华中农业大学 硕士学位论文 猪肌注氟苯尼考的药动学-药效学研究 姓名：董静 申请学位级别：硕士 专业：基础兽医学 指导教师：袁宗辉;黄玲利
华中农业人学２００８届硕ｆ：学位论文猪肌注氟苯尼考的药动学．药效学研究研究生： 董静 导师： 袁宗辉教授（国家兽药残留基准实验室（ＨＺＡＵ）脓业部食品安全评价重点歼放实验室，华中农业大学中国武汉４３００７０）摘要药动学．药效学模型研究是抗菌药物合理应用的基础，对于全面反映药物、宿主及微生物三者之间的关系，评价药物疗效，制定最佳临床给药方案具有重要的理论和实际意义。目前对ＰＫ．ＰＤ模型研究较多的主要有四类药即Ｄ．内酰胺类药、氟喹诺 酮类药、大环内酯类药和氨基糖苷类药，而对于氯霉素类，目前还未见报道。氟苯尼考是化学合成的第三代氯霉素类抗菌药物，是动物专用广谱抗菌药物，它克服了氯霉素具有抑制造血功能及再生障碍性贫血的缺点，同时增强了抗菌效果，其安全 性和有效性均比氯霉素和甲砜霉素好。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引 起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，是世界性规模化养猪的重要疫病之一， 给养猪业造成了巨大的经济损失。氟苯尼考是治疗猪传染性胸膜肺炎的首选药物， 临床上应用广泛，但存在问题是滥用和误用现象严重，而滥用会导致猪胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考产生耐药性，从而使临床治疗失败。药物的疗效与感染部位组织 中的药物浓度直接相关，组织中要保证得到有效治疗浓度，氟苯尼考必须具有很好 的组织穿透性，用组织笼考证氟苯尼考的组织穿透性。同时，药物是通过血液循环 到达病变组织的，并且血清中药物浓度和猪胸膜肺炎放线杆菌的清除有更好的相关性。因此，本课题通过研究氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学和氟苯尼考在猪体内的药动学，通过Ｈｉｌｌ方程把氟苯尼考对猪的药动学和药效学相结合，建立 起氟苯尼考在猪血清和组织笼液的ＰＫ．ＰＤ模型，根据建立好的ＰＫ．ＰＤ模型来预测氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的合理给药方案，从而避免耐药性的发生，延长氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的寿命。采用微量稀释法测定氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）和最低杀菌浓度（ＭＢＣ）。首先制备菌悬液，同时将氟苯尼考待测质量浓度设为１２８．００、６４．００、３２．００、１６．００、８．００、４．００、２．００、１．００、０．５０、０．２５、Ｏ．１２５９９／ｍＬ，每个质量浓度设三个重复。通过９６微孔板测定最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，以目测法找出始变澄清的第一孔，该孔中所含药物浓度，即为ＭＩＣ，然后取高浓度液体氟苯尼考给猪肌注的药动学一药放学研究培养物０．１ｍｌ接种于含小牛血清和辅酶１（ＮＡＤ）的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂（ＴＳＡ） 平板上，３７℃继续培养２４ｈ，以无菌落出现的最低药物浓度即为ＭＢＣ。通过微量稀释法测得氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）和最低杀菌浓度（ＭＢＣ）分别为Ｏ．５９ｆｆｍＬ和ｌｇｇ／ｍＬ，表明氟苯尼考对猪胸膜肺灸放线杆菌有很强 的杀菌活性。依据最低抑菌浓度（ＭＩＣ）结果采用１／２ＭＩＣ、１ＭＩＣ、２Ｍ！Ｃ、４Ｍ！Ｃ、８ＭＩＣ、１６ＭＩＣ、６４ＭＩＣ的系列氟苯尼考浓度对猪胸膜肺炎放线杆菌做杀菌实验，在Ｏ、１、 ２、４、８、１２、２４ｈ分别吸取０．１ｍＬ培养物涂于含有小牛血清和辅酶ｌ的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂平板上，３７℃孵育１８ｈ后进行菌落计数，并以不同时间点菌落数的常 用对数绘制杀菌曲线。通过杀菌实验结果，从杀菌曲线上可明显看出氟苯尼考随着浓度的增加，氟苯尼考的杀菌活性增大，表明氟苯尼考属于浓度依赖性抗菌药物。选取５ｍＬ塑料离心管，在其表面打孔，制成组织笼，灭菌烘干。选择２０～２５ｋｇ 健康仔猪，以盐酸普鲁卡因进行局部麻醉，于耳后颈部两侧皮肤以无菌手术分别切开皮肤形成一２～３ｃｍ的小口，露出肌肉，向下方钝性分离肌肉和皮肤，使肌肉和皮 肤之间形成一个空腔，然后植入组织笼并缝合切口。五周后组织笼感染模型建好。 以２０ｍｇ／ｋｇ体重肌注氟苯尼考，分别于Ｏ、１５、３０ｍｉｎ及ｌ、１．５、２、３、４、６、９、１２、 １５、２４、３６、４８ｈ采集血清并于０、１、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ采集组织笼液， 用气相色谱．微电子捕获检测技术测得各点血清和组织笼液中氟苯尼考的浓度。结果表明：猪肌注氟苯尼考后的血药经时过程和组织笼液经时过程均符合一室歼放模型，主要药物动力学参数如下：血清中吸收半衰期ＴｉｎＫ。为１．５０士Ｏ．７６ｈ，消除半衰期Ｔｌ／２Ｋｂ 为１１．１６４－３．３６ｈ，ＡＵＣ为２４．７６＋５．３６ｈ木ｐ，ｇ／ｍＬ，Ｔｍａｘ为２ｈ，Ｃｍａｘ５．９３４－１．６３ｐｇ／ｍＬ；组织笼液中穿透半衰期Ｔｉ／２Ｋｐｅｎ为４．６２＋１．１９ｈ，消除半衰期Ｔｌ／２Ｋｂ为１７．３５＋０．５７ｈ，ＡＵＣ为４９．０９－４－７．０４ｈ木１．ｔｇ／ｍＬ，Ｔｍａｘ为１２ｈ，Ｃｍａｘ为３．２０－３：０．８９９９／ｍＬ。从半衰期可以看出氟苯尼考在血清中吸收很快，氟苯尼考从血清中渗透到组织笼中的速度很慢且氟苯尼考 在组织笼液中的消除较慢。微量稀释测定Ｏ、ｌ、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ的血清和组织笼液的间接杀菌活性。从间接杀菌曲线结果可知：血清中１、３、６ｈ氟苯 尼考有很强的杀菌活性，孵育２４ｈ后几乎所有的细菌都被杀死，９ｈ时氟苯尼考有较弱 的抑菌活性，而１２、１５、２４、３６、４８ｈ的氟苯尼考没有抑菌活性。组织笼液中氟苯尼 考在６、９、１２、１５、２４ｈ氟苯尼考有很强的杀菌活性，孵育２４ｈ后几乎所有的细菌都 被杀死，３ｈ时氟苯尼考有较弱的抑菌活性，而ｌ、３６、４８ｈ的氟苯尼考没有抑菌活性。２华中农业大学２００８届硕ｌｊ学位论文采用ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ软件对药动学和药效学数据拟合知氟苯尼考在猪体内的ＰＫ．ＰＤ模型为Ｓ形Ｅｍａｘ模型ＮＩＨｉｌｌ模型。通过Ｈｉｌｌ方程处理ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ值与抗菌疗效之间的关系，可知血清中ＡＵＣ２４ｄＭＩＣ为２３．６９时，开始有抑菌作用，ＡＵＣ２４．／ＭＩＣ为 ２４．３３时能抑Ｎ５０％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｄＭ！Ｃ为２５．９６时能抑制９９．９％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｈ／Ｍ｜Ｃ为５２．３３时能够彻底清除病原菌的生长。在组织笼液中当ＡＵＣ２４ｈＭＴＣ为２２．３８时开始有抑菌作用，ＡＵＣ２４Ｉｊ／ＭＩＣ为２５．３ｌ时能抑制５０％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｈ．．／ＭＩＣ 为２６．３４时能抑制９９．９％的细菌生长，ＡＵＣ２４．／ＭＩＣ为５ １．６４时能够彻底清除病原菌的生长。Ｎｍ公式ｘ：旦兰．！．堡！丝塑攀±ｉ！丝笙！竺翌尘可知要想取得抑菌效果，临床最 一一’。。。 ＡＵＣ，．。／ＭＩＣ（ｉｎｖｉｖｏ）‘…。‘低给药剂量为１０．９５ｍｇ／ｋｇ。综上所述，本课题首次阐明了氟苯尼考的ＰＫ．ＰＤ特性即氟苯尼考属于浓度依赖 性抗菌药物，具有浓度依赖性抗菌药物的共性，其ＰＫ．ＰＤ参数为ＡＵＣ／ＭＩＣ和Ｃｍａｘ／ＭＩＣ，同时通过ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ软件拟合药动学和药效学数据得氟苯尼考在猪体内 的ＰＫ．ＰＤ模型为Ｓ形Ｅｍａｘ模型，并确定了氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的临床给药剂量。 研究结果为避免临床上滥用和误用氟苯尼考提供了依据，从而可以减少细菌耐药性 的发生，并在一定程度上为养殖户节约成本。关键词：ＰＫ．ＰＤ模型；氟苯尼考；组织笼；猪；猪胸膜肺炎；气相色谱；间接 杀菌活性氟苯尼考给猪肌注的药动学一药放学研究Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ―－ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆｉｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ Ｆｌｕｉｄ ｏｆ ＳｗｉｎｅＣａｎｄｉｄａｔｅ：Ｄｏｎｇ ｊ ｉｎｇＡｄｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｙｕａｎ ＺｏｎｇｈｕｉＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ＤｒｕｇＲｅｓｉｄｕｅｓ／ＭＯＡＫｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＦｏｏｄ Ｓａｌｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩｖｖＩ７。ｕ．１Ｉ．１ａ－ｎ，Ｈｕｂｅｉ，４．）０ｕ／ｕ，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＰＫ―ＰＤ ｍｏｄｅｌ，ａｓ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌａｂａｓｉｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙｔｏ ｒｅｆｌｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｍｏｎｇ ｄｒｕｇ，ｈｏｓｔ ａｎｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｉｔ ａｌｓｏｄｏｓａｇｅｃａｎｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｏｐｔｉｍａｌｏｎｒｅｇｉｍｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ＰＫ―ＰＤ ｍｏｄｅｌｎｏＢ―Ｌａｃｔａｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ＦＱＮＳ，ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ．ＢｕｔｒｅｓｅａｒｃｈｏｎＣｈｌｏｒｏｍｙｃｅｔｉｎ ｗｅｒｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｓ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｍｙｃｅｔｉｎ ａｎｄ ｉｔｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｉｔｃａｎｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ，ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｒｅａｔｉｎｇ ａｐｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｍｙｅｔｉｎ．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｓ ｗｈｉｃｈ ａｌｍｏｓｔ ｓｐｒｅａｄ ａｌｌｔｏ ｔｒｅａｔｏｖｅｒ ａｎｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｔｏｕｃｈ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔｄｉｓｅａｓｅｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ａｎｄ ｃａｕｓｅｄ ｌａｒｇｅ ｌｏｓｓ．Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｄｒｕｇｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ．Ｈｏｗｅｖｅｒ ａｂｕｓａｇｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｓｕｓｉｎｇ ｏｆＦｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄｃａｕｓｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ．Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｍｕｓｔ ｈａｖｅ ｇｏｏｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅＵａｔｉｎｇ ｉｎ ｏｒｄｅｒｔｏｒｅａｃｈｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｔｉｓｓｕｅｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅｃａｇｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｄｒｕｇｗａｓ ａｒｒｉｖｅｄ ａｔｌｅｓｉｏｎｓ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｂｌｏｏｄ ｓｔｒｅａｍ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｂｅＲｅｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈｃｌｅａｒａｎｃｅｒａｔｅｏｆ Ｐｅｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａ 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ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｐｅｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｋｉｌｌｉｎｇ ｃｕｒｖｅｓ．ｗｅｃａｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＦｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｉｓｉｎｇ．７ｌ＇ｈｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔｓ．１ ０ｍｌ ｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｏ ｍａｋｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｓ．Ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｄｏｓｉｎｇ，ｔｗｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｓ ｐｅｒ ａｎｉｍａｌ，ｏｎｅ ｏｎｅａｃｈ ｓｉｄｅｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌｐａｒｔ，ｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｎｏａｃｉｎｅｌｏｃａｌａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ．Ｆｉｖｅ ｗｅｅｋｓ ｗｅｒｅ ａｌｌｏｗｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｓ ｔｏ ｐｅｒｍｉｔ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｓｉｘ ｓｗｉｎｅ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ２０ｍｇ／ｋｇ ＦｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌＩＭｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｐａｒｔ．Ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｔ ０、１５、３０ｍｉｎ ａｎｄ ｌ、１．５、２、３、４、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｔ ０，１，３，６、９，１２，１ ５、２４、３６，４８ｈ。Ｔｈｅｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｓｅｒｕｍ ａｎｄｏｎｅｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｉｔｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｓｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｐｅｎ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ａｌｌｉｓ １．５＋０．７６ｈ，ＴＩ／２Ｋｂ ｉｓｆｏｌｌｏｗｓ：ＴＩ／２Ｋａ１ １．１６士３．３６ｈ，ＡＵＣ ｉｓ ２４．７６４－５．３６ｈ木Ｉ，ｔｇ／ｍＬ，Ｔｍａｘ ｉｓ ２ｈ ａｎｄ Ｃｍａｘ ｉｓ ５．９３士１．６３１ｘｇ／ｍＬ ｉｎｓｅｒｕｍ；Ｔｌ／２ＫｐｅＩｌ ｉｓ ４．６２士１．１９ｈ，ＴＩ，２Ｋｂ ｉｓ １７．３５士０．５７ｈ，ＡＵＣ ｉｓ ４９．０９－士７．０４ｈ木ｇｇ／ｍＬ，Ｔｍａｘｉｓ １ ２ｈａｎｄ Ｃｍａｘｉｓ ３．２０士０．８９Ｉ．ｔｇ／ｍＬ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ．Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ Ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｉｎｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ．Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｓ ｓｌｏｗｌｙ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｓ．Ｔｈｅｅｘａｎｄｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎｖｉｖｏａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｆｌｕｉｄｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｅｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｎｄｋｉｌｌａｔ １ ０ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ：０，１，３，６，９，１ ２，１ ５，２４，３６，４８ｈ ａｆｔｅｒ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｄｏｓｉｎｇ．Ａｔ １，３ ｅｘｅｒｔｅｄａ６ｈ ｐｏｉｎｔ，Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｓｅｒｕｍｐｏｗｅｒｆｕｌ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｗｈｉｃｈｃａｎａｌｍｏｓｔ ａｌｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｆｔｅｒ ２４ｈａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ａｔ ９ｈ ｐｏｉｎｔ，Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｈａｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ １２，１５，２４，３６，４８ｈ ｐｏｉｎｔ ｉｎｗｅａｋｓｅｒｕｍ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，Ａｔ ６，９，１２，１５，ａｎｄａ２４ｈ ｐｏｉｎｔ，Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ ｅｘｅｒｔｅｄｐｏｗｅｒｆｕｌ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｗｈｉｃｈＣａｎｋｉｌｌ ａｌｍｏｓｔ ａｌｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｆｔｅｒ ２４ｈ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ａｔ ３ｈ ｐｏｉｎｔ，Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｆｌｕｉｄｓ ｈａｓｗｅａｋａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ １ ２，１ ５，２４，３６，４８ｈ ｐｏｉｎｔ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ． ＰＫａｎｄＰＤ ｄａｔａ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙＷｉｎＮｏｎｌｉｎｓｏｆｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＫ－ＰＤ ｍｏｄｅｌ ｏｆＦｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌｗａｓＥｍａｘｍｏｄｅｌ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｅｘｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ａｎｄ５氟苯尼考给猪肌注的药动学一药效学研究ａｎｔｉｂｉｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｗｅｒｅ ｈａｎｄｌｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｈｉｌｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ．ＳｅｒｕｍＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣｖａｌｕｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉＳ ２３．６９，５０％ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ ｉＳ ２４．３３，９９．９％ｆｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉＳ ２５．９６ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉＳ ５２．３３．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｖａｌｕｅｓ佑ｒ ｔｉｓｓｕｅｃａｅｅｆｌｕｉｄｓｖｅｅｒｅａｌｍｏｓｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ（２２．３８，２５．３ ｌ，２６．３４．５１．６４）．Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｌｏｗｅｓｔ ｄｏｓａｇｅｉｓ ｉ０．９５ｘ：丝掣筹攀裂罂娑型，ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ． Ｉｎｍ幽ｔ。ｔｏｓｕｍｍａｒｙ，ｔｈｉｓ ｔｏｐｉｃ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅｔｏｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈａｔ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｂｅｌｏｎｇｓａｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ＰＫ―ＰＤ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓＡＵＣ／ＭＩＣａｎｄＣｍａｘ／ＭＩＣ．Ｉｔ ｄｅｆｉｎｉｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐ ｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ． Ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｆｅｒｅｄａｌｌｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｏ ａｖｏｉｄ ａｂｕｓｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｓｕｓｉｎｇ ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ，ｔｈｕｓｃｏｓｔｃａｎｇｒｏｗｄｏｗｎｗａｒｄｓ ｄｒｕｇ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓａｖｅｆｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＰＫ－ＰＤ ｍｏｄｅｌ；Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ；Ｓｗｉｎｅ；Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ； Ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ；Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ；Ｅｘｖｉｖｏａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ６华中农业大学２００８届硕匕学位论文缩略语表７华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学泣论史 是否傈密如需保密．解密时问 独创性声明年月目本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：踅暂时间：年月日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并进行信息服务（包括但不限于汇编、 复制，发行、信息网络传播等），同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文（即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文）在解密后适用于本授权书。学位论文作者挠踅箭签名日期： 年 月日导师挠老觌孕签名日期： 年 月日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间氟苯尼考给猪Ｉｔ／ｔ沣的药动学一药效学研究ｌ前言１．１研究背景氯霉索类抗菌约自问世以来，对畜禽的疾病控制和治疗起到了荤要作用。由于氯霉素存在严重的副作用，ｚｆｊ‘匕ｌ－，引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疚病，各国相继禁止或严格限制使用氯霉素。甲砜霉素虽然毒性作用小，但抗菌效果不及氯霉素，因此，限制了它的临床使用。氟苯尼考是一种化学合成的氯霉素类动物专 用的新型广谱抗菌药，８０年代由美国先灵葆雅公司研制，１９９０年首次在日本上市， 主要用于水产养殖业（李秀波和石波，１９９９；邓立斌等，２００５）。该药以其广谱、 高效、低毒、吸收良好、体内分布广泛和无潜在的致再生障碍性贫血等特点而备受 兽医界的关注和欢迎。目前，该药已先后在日本、韩国、挪威、法国、英国、奥地 利、墨西哥、西班牙、美国等国注册（萧志梅，２０００）。我国于１９９０年批准上市， 主要用于治疗有敏感菌引起的猪、牛、鸡和鱼的细菌性疾病（邱银生和吴佳，１９９６）。 自氯霉素被欧美等国严禁用于食品动物（包括鱼类）之后，国外兽医界对氟苯 尼考的药动学进行了广泛和深入的研究，其研究对象涉及了牛、猪、鸡、兔等动物。 氟苯尼考内服和肌注均吸收迅速，生物利用度高，在体内分布很广泛。临床用药时， 在发病初期，患病猪群还有较好食欲的情况下，可采用混饲给药，但对于发病较严 重和食欲较差的猪群，一般采用肌注给药。氟苯尼考的抗菌效应也被广泛研究。氟 苯尼考对革兰氏阴性菌和阳性菌均有效，尤其对多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆 菌、肺炎霉形体和链球菌的作用更好。对耐氯霉素和甲砜霉素的大肠杆菌、沙门氏 菌、克雷白菌亦有效。Ｕｅｄａａｎｄ Ｓｕｅｎａｇａ（１９９５）测定氟苯尼考和甲砜霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌的ＭＩＣ，发现血清型不同，其ＭＩＣ有很大差异（表１）。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ等（２００２）研究了氟苯尼考等１６种抗菌药对临床分离的６８株猪胸膜肺炎放线杆菌的 抗菌活性，结果发现，氟苯尼考对该病原菌的ＭＩＣ、ＭＩＣ５０和ＭＩＣ９０分别为０．１～ ０．７８、Ｏ．３９和０．３９ｒｔｇ／ｍＬ，氟苯尼考对临床分离株的敏感率为１００％。目前氟苯尼考 已成为氯霉素禁用后的主要替代品种，在兽医临床上发挥着重要作用。我国的畜牧业主要包括饲养牛、羊、鸡和猪等，养猪业已经由副业生产转变为商品化的产业生产。目前大型猪场日益增多，由于缺乏专业的兽医知识，兽药滥用 情况较为严重，不仅造成动物中毒，动物性食品中兽药残留超标问题普遍存在。由 于细菌普遍存在耐药性，而且新药对细菌产生耐药性的速度也相当迅速，因此迫切８华中农业大学２００８届顾卜学位论文需要一种好的指导预防和治疗猪的各种疾病的给药方法指导。表１氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的ＭＩＣＴａｂｌｅ Ｉ Ｔｈｅ Ｍ｜Ｃ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｅｏ！ａｇａｉａｓｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种高度接触传染性呼吸 道疾病。该病于１９５７年由英国Ｐａｔｔｉｓｏｎ等首次报道，几乎遍及世界上所有的养猪业国家，是世界性规模化养猪的重要疫病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失（斯 特劳等，２００３）。该病在我国自１９８７年报道以来，流行广泛，且发病率呈现逐年增 长的趋势（徐晓娟等，２００３；刘春花等，２００３），给我国的养猪业造成了很大的损失。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的出血性坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，可发生任何年龄的猪只，但以３月龄仔猪最易感。猪胸膜肺炎剖检 变化主要发生在呼吸道，病猪的肺、扁桃体、血液、鼻液中容易分离到胸膜肺炎放线杆菌。氟苯尼考是治疗猪传染性胸膜肺炎的首选药物，１９８９＂－＇－－＂１９９３年Ｒ本的调查 显示，从患胸膜肺炎的猪肺中分离到的９０种胸膜肺炎放线杆菌，均对氟苯尼考敏感，氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度范围足０．２～１．５６ｍｇ／ｍＬ，最佳抑菌 浓度为０．３９ｍｇ／ｍＬ。迄今为止，胸膜肺炎放线杆菌被报道的血清型共有１５个，我国 流行的血清型以ｌ、３、７型为主（逯忠新等，２００２）。临床指导氟苯尼考抗菌治疗主要依据体外获得的静态数据如最低抑菌浓度 （ＭＩＣ）和最低杀菌浓度（ＭＢＣ），但ＭＩＣ仅仅是病原菌对药物敏感性的一个指标， 忽略了抗菌药物在体内按一定规律变化的特点（傅得兴等，１９９７）。越来越多的研究表明ＭＩＣ与临床结果不完全一致，不能很好预测临床结果，因此，根据ＭＩＣ设计给药方案并不是理想方法。同时，由于微生物耐药和治疗间交叉耐药的迅速发展，已经影响到对多种疾病的经验治疗。由于新药开发费用巨大，只有极少的新药可用９氟苯尼考给猪肌注的药幼学一药效学研究作替代治疗。因此有必要充分利用现有抗菌药物，避免药物暴露在亚致死药物浓度 水平，减少耐药发生率（Ｂｕｒｇｅｓｓ．１９９９）。才能更好的延长现有抗菌药物的使用寿 命。凶此，有必要找到一种新的指导氟苯尼考临床用药的方法。 约物的疗效与感染部位组织中的约物浓度直接自关，为保证组织中能达剑自效 治疗浓度．咖．药浓度麻达到该药对致病菌晟低抑菌浓度的２倍以．｝＝。药物必须在病灶部位达到足够的浓度，才能对潜伏在组织深部的致病菌具有杀灭或抑制作用，药物进入组织巾的浓度取决于药物的理化特性，血浆蛋白结合率，局部血流量及膜通透性等。此外，疾病和病理状态等也有影响。在正常全身给药后，支气管、肺组织 中的药物浓度较血药浓度低（１／３０＂－－＂１／４０）提示有肺一血或支气管一血屏障存在。所以，呼吸道疾病的药物选用，对抗菌药物而言，仅仅依靠药敏试验结果来选用药物是不够的，还要看这种药物的穿透能力；在痰液中的穿透性和分布浓度；在靶器官分布情况（药物的靶向性）；在巨噬细胞的富集情况；药物动力学特征（维持有效浓度的时间）；是否有助于防止胸膜肺炎导致的炎性渗出等病理过程。 氟苯尼考生物利用度高，可透过血脑屏障，肺组织药物浓度为血清的９０％，气管腔药物浓度高于血清药物浓度。Ａｐｌｅｙ军ＨＵｐｓｏｎ（１９９３）曾研究过单诺沙星血浆药 物动力学和肺部浓度及支气管分泌物的关系，发现由于肺部内容物相对比较复杂，代表的是一个混合的效应室，因此肺部浓度容易给临床上用药造成误导，血清和支气管分泌物相对于肺部浓度而言，与清除细菌有更好的相关性。同时，利用组织笼 考证氟苯尼考的组织穿透性，组织笼液动力学可以模拟氟苯尼考在病变组织的浓度变化，从而为临床治疗猪胸膜肺炎提供更好的指导。药动学．药效学（ＰＫ．ＰＤ）模型的研究结合了药动学（ＰＫ）和药效学（ＰＤ）的 研究方法，旨在研究某一给药剂量相应的时间．效应过程。目前随着ＰＫ．ＰＤ研究的日益深入，对药物的体内过程和药效的相关性的进一步了解，使得ＰＫ．ＰＤ模型的研究 己成为现代药物治疗学的热点。通过ＰＫ．ＰＤ模型，可以认识药物在体内的处置过程及作用特性，预测任一时刻的药物浓度及效应强度，并以此制定合理的给药方案（Ｔｏｕｔａｉｎ ａｎｄ Ｌｅｅｓ，２００４）。因此，ＰＫ．ＰＤ模型研究是抗菌药物合理应用的基础，对于全面反映药物、宿主及微生物三者之间的关系，评价药物疗效，制定最佳临床给 药方案具有重要的理论和实际意义。 目前对ＰＫ．ＰＤ模型研究较多的主要有四类抗菌药即Ｂ．内酰胺类药、氟喹诺酮类 药、大环内酯类药和氨基糖苷类药。Ｂ．内酰胺类药是典型的时间依赖性抗菌药物，１０华中农业大学２００８届硕｝学位论文给药方案的目的是暴露时间的合理化，即使Ｔ＞ＭＩＣ的时间最大化，研究表明这类药物合理给药方案应当足游离血清浓度超过ＭＩＣ的时间至少应为给药间隔的４０％－－５０％，采用一同多次给药方案（ＭａｃｇｏｗａｎａｎｄＢｏｗｋｅｒ，１９９８）。氟喹诺酮类药、大环内酯类药和氨基糖昔类约属于浓度依赖性抗菌约，ＡＵＣｏ、２４ ｈ／ＭＩＣ与细菌学疗效最为 相关，当ＡＵＣ０～２４ｈ／ＭＴＣ＞１ ００和／或Ｃｍａｘ／ＭｌＣ＞８时可发挥良好的细菌学疗效（ＭｃＣｏｉｇｅｔａ１．，１９９９）。对于氯霉素类，目前国内外未见关于其ＰＫ．ＰＤ模型研究的报道。 目前，研究ＰＫ．ＰＤ模型理论的方法主要有体外模型、动物感染模型和间接体内方法。体外模型虽已广泛用于各种抗生素的研究，也取得了大量的研究成果，但与体内情况相比仍有较大的缺陷。体外模型不涉及动物机体免疫功能对病原微生物的 清除作用，所得结果单纯反映抗菌药物的独立作用，对免疫功能缺陷的感染可能有 较好的指导作用。动物感染模型是检测药效学参数和体内药效学关系的有效方式，然而由于蛋白质结合的作用，药物动力学和动物免疫系统的影响，可能会得到非常 复杂的结果。另外，体内数据一般利用定性计数指标如成功或失败，死亡或存活， 敏感或耐药来分析，而没有明确的定量标准来检测抗菌活性。间接体内（ｅｘ方法不同于体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究，多在动物皮下埋植组织笼（Ａｌｉａｂａｄｉｖｉｖｏ）ａｎｄ Ｌｅｅｓ，１９９７），动物给药后定时抽取组织笼内样品，进行药物浓度和ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌活力测定，然后将ＰＫ．ＰＤ参数与ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌活力相关联，通过ＰＫ．ＰＤ模型分析确定ＰＫ．ＰＤ参数临界点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）的值，以此预测给药剂量。Ｅｘ ｖｉｖｏ的研究方法实现了抗菌药动力学和药效学研究的同步，可作为一种新的确定给药剂量的方法。 国外己通过间接体内ＰＫ．ＰＤ方法建立了单诺沙星在牛的ＰＫ．ＰＤ模型，预测了 取得不同抗菌疗效（如抑制、杀灭、彻底清除病原菌）单诺沙星的使用剂量（Ａｌｉａｂａｄｉ ａｎｄ Ｌｅｅｓ，２００３）；同时通过间接体内ＰＫ．ＰＤ方法建立了单诺沙星在羊的ＰＫ．ＰＤ模 型（Ａｌｉａｂａｄｉ ａｎｄ Ｌｅｅｓ，２００１）。利用ＰＫ．ＰＤ方法认识到从剂量到反应有两个主要过 程，第一步是ＰＫ过程即剂量转变成血药浓度，第二步是ＰＤ过程即血药浓度和效应的关系。用这种方法可估计ＥＣ５０（Ｅｍａｘ／２时的浓度），从而估计药物的作用强度，在ＰＫ．ＰＤ试验中，血药浓度可提供任意时间的药物作用。氟苯尼考对畜禽呼吸系统、消化系统病原菌具有高度的敏感性。但药物的疗效 与感染部位组织中的药物浓度直接有关，为保证组织中能达到有效治疗浓度，氟苯 尼考必须具有很好的组织穿透性，利用组织笼模拟病变组织肺，从而考证氟苯尼考渗透到肺组织的穿透性。另外，由于肺是一个混合的效应室，与细菌清除率的相关氟苯尼考给猪叽沣的药动学一药效学研究性不是很好，测定其与细菌清除率之间的关系易给临床造成误导。而药物是通过血 液循环到达病变组织的，并且血清中药物浓度和猪胸膜肺炎放线杆菌的清除率有更好的相关性，因此可通过测定血清中药物浓度与细菌之间的关系来预测临床给药方案。１．２研究内容和目的意义综上所述，本实验通过氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的抑菌试验考汪氟苯尼 考的ＰＫ．ＰＤ特性，同时通过在猪颈部皮下埋植组织笼，肌注氟苯尼考后研究氟苯尼考在猪体内的药动学特征和ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌活性，通过Ｈｉｌｌ方程处理ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／Ｍ［Ｃ值与抗菌疗效（病原菌数目的减少）之间的关系，确定ＡＵＣ２４ｈｆＭｌＣ的临界值（抑 制、杀灭、彻底清除病原菌），从而为临床治疗猪胸膜肺炎提供合理的给药方案， 以避免长期大量使用导致氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌产生耐药导致临床治疗失败，并可避免大量使用氟苯尼考导致氟苯尼考在猪组织中的药物残留，对提高猪肉 产品质量，保障人们身体健康，增加猪肉产品的国际竞争力，维护生态环境条件与 经济发展协调统一，以及促进我国畜牧业可持续发展都具有重要意义。１２毕中农业人学２００８届颀卜学位论文２材料与方法２．１药品与试剂氟苯尼考标准品，批号：２００４０６２４，纯度９９．１％，张家港横盛集团。 四环素标准品，含量９７％，中国兽医药品监察所提供。盐酸普鲁卡因（Ｏ．０５％），批号：２００７０６１９，开封制药集团有限公司。 青霉素钠（１６０万单位／次），批号：２００７１０２３，福建汇天生物药业有限公司。碘酊，批号：２００７１ １０６，邯郸市英利康制药厂。ＳｙｌｏｎＢＳＴＦＡ，批号：Ａ０２２９３８２，Ｓｕｐｅｌｃｏ公司。甲醇，分析纯，批号：Ｔ２００７０６０８，国药集团化学试剂有限公司。 乙腈，分析纯，批号：Ｔ２００７０２２５，国药集团化学试剂有限公司。 乙酸乙酯，分析纯，批号：Ｔ２００７０３２１，国药集团化学试剂有限公司。 甲苯，分析纯，批号：Ｔ２００７０６２４，国药集团化学试剂有限公司。 氢氧化钠（ＮＡＯＨ），分析纯，批号０７１２１１，大津市风船化学试剂科技有限公司。辅酶ｌ（ＮＡＤ），批号０６０７１８，含量９０％，上海伯奥生物科技有限公司。小牛血清，批号０７０９１０，杭州四季青生物工程材料有限公司。胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂（ＴＳＡ），批号：６２２８４２７，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ。 胰酶解大豆酪蛋白胨液体培养基（ＴＳＢ），批号：６０９４５５７，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ，ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ。 准确称取氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品各１０ｍｇ，分别置于１０ｍＬ容量瓶中，用ｃｏｍｐａｎｙ，乙腈溶解定容至１０ｍＬ，制成ｌｍｇ／ｍＬ的标准储备液，４。Ｃ冰箱保存。临用前用乙腈稀释成所需浓度的工作液。 １０２４１ａｇ／ｍＬ氟苯尼考标准储备液：精确称取氟苯尼考标准品１０．３３ｍｇ，用甲醇助 溶后，用双蒸水定容至１０ｍＬ，配成１０２４９９／ｍＬ原液，置一２０。Ｃ冰箱保存备用，临用时 用胰酶解大豆酪蛋白胨液体培养基（ＴＳＢ）稀释至工作浓度。 １０２４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ四环素标准储备液：精确称取四环素标准品１０．３３ｍｇ，用双蒸水定容 至１０ｍＬ，配成１０２４９９／ｍＬ原液，置．２０。Ｃ冰箱保存备用，临用时用肉汤稀释至工作浓 度。 １０ｍｇ／ｍＬ辅酶ｌ（ＮＡＤ）储备液：精确称取ＮＡＤｌ００ｍｇ，用双蒸水定容至１０ｍＬ，氟苯尼考给猜肌注的药动学一药效学研究配成１０ｍｇ／ｍＬ溶液，置一２０。Ｃ冰箱保存备用。各药物原液分装于１．５ｍＬ离心管中置 ．２０℃冰箱保存备用。０．０１ｍｏｌ／ｍＬ磷酸盐缓冲液：称取三水结晶磷酸氢二钠２．２８９，ｊＪＨ／ｋ９００ｍＬ水溶解，磷酸调ｐＨ垒７．０，加水定容垒１０００ｍＬ。 ０．５ｍｏｌ／ｍＬ氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠ｌＯｇ。用蒸馏水溶解，冷却后定容至５００ｍＬ。２．２主要仪器设备Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ气相色谱仪，ＥＣＤ检测器，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司。Ｓｉｌｏｘａｎｅ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ３０．Ｏｍ ｘ２５０ｐｍｘ０．２５１，ｔｍ ｎｏｍｉｎａｌ，气相色谱柱，Ｒｔｘ一５ Ｍｅｔｈｙｌ 日本岛津公司。高纯度氮气，９９．９９９％，武钢氧气有限责任公司。电子天平，感量０．００００１９，日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ公司。 高速匀浆机，ＡＭ。６日本ＡＣＥ公司。旋涡混合器，江西医疗器械厂。 高速冷冻离心机，ＨＩＴＡＣＨＩＣＲ２１Ｇ，日本日立公司。离心机，ＬＤ４．２Ａ，上海飞鸽仪器厂。 电热恒温水浴锅ＨＨ型，金坛市佳美仪器厂。ｐＨ测定仪，Ｐｈｓ．２５Ａ，上海同岛科学仪器有限公司。电热干燥箱，ＤＧＸ．９２４３Ｂ．１，上海福玛实验设备有限公司。混合纤维素脂微孔滤膜，批号２００７０１ １５，孔径０．２２１，ｔｍ，上海半岛实业有限公司净化器材厂。一次性使用培养皿，批号：２００７１０２１，浙江拱东医用塑料厂。 一次性使用注射器（５、１０ｍＬ），批号：２００７０１ １２，洪湖泰宁医疗器械有限公司。其他：９６微孔板，灭菌锅，净化工作台，电热培养箱，微量加样器（２０＂－－－２００ｐＬ、 １００＂－＇－＂１０００ｐＬ、５～１０１．ｔＬ），塑料离心管、手术刀、手术剪、缝针等。２．３动物健康的杜长大商品猪６头，８周龄左右，体重￥２０－－－，２５ｋｇ，公母各半，按常规饲养，自由饮水和采食，饲料为不含抗菌药物的全价同粮，实验前观察一周。１４华中农业大学２００８届硕｝：学位论文２．４菌种及菌液配制猪胸膜肺炎放线杆菌七型（ｐｎｅｕｍｏｎｉａＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＶＩＩ）ＣＶＣＣ２６５，由中国兽医药品监察所提供。大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２，华南农业大学药理实验室惠赠。取冻干菌种，按照冻干菌种恢复培养方法使菌种复苏，将复苏菌种分别接种于含辅酶ｌ（ＮＡＤ）与不含ＮＡＤ的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂（ＴＳＡ）平板上，３７℃培养１８ｈ。菌种在未含有ＮＡＤ的培养平板上不生长，而在含ＮＡＤ的培养平板上生长。 挑取在含ＮＡＤ的培养平板上生长的单个菌落于ＮＡＤ／ＴＳＡ平板上进行纯培养，置３７℃温箱中培养１８ｈ后，４℃保存，即为原菌液。采用平皿表面计数法确定原菌液浓度，再用灭菌生理盐水稀释至ｌ×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的菌液备用。对数生长期菌液配制：将８～１０个待测菌落接种于９ｍＬ的胰酶解大豆酪蛋白胨液体培养基（ＴＳＢ）中，３７℃培养过夜，即达到对数生长期。２．５培养基配制供菌株生长的液体培养基为胰酶解大豆酪蛋白胨液体培养基（ＴＳＢ），称取 ＴＳＢｌ５９，加入双蒸水５００ｍＬ充分溶解，然后高压蒸汽灭菌，临用前］ＪＨＮＡＤｌｏｐ．ｇ／ｍＬ， ５％＇－－１０％的小牛血清。供菌株生长的培养基平板为含有ＮＡＤ的ＴＳＡ平板，称取 ＴＳＡ２０９，加入双蒸水５００ｍＬ，高压蒸汽灭菌，待温度降至５０℃左右时，加入 ＮＡＤｌ０Ｉｔｇ／ｍＬ，５％～１０％的小牛血清。２．６氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌实验２．６．１最，Ｊｑｌ：ｐ菌浓度和最小杀菌浓度测定采用微量稀释法测定氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）和最小杀菌浓度（ＭＢＣ）。 菌悬液的制备：从培养平板上挑取单一菌落接种于５ｍＬ含有小牛血清和ＮＡＤ的 ＴＳＢ液体培养基中，于摇床（２００ｒ／ｍｉｎ，３７℃）上震荡培养６ｈ，将ＴＳＢ液体培养基增 菌的细菌做１０倍稀释成１０～、１０之、１０一、１０４、１０一、１０‘６、１０一、１０一、１０’９浓度梯度。采用平皿表面计数法确定原菌液浓度，再用含有ＮＡＤ和小牛血清的ＴＳＢ液体培养基 稀释至ｌ×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的菌液备用。 将氟苯尼考待测质量浓度设为１２８．００、６４．００、３２．００、１６．００、８．００、４．００、２．００、 １．００、Ｏ．５０、０．２５、Ｏ．１２５｝ｔｇ／ｍＬ，每个质量浓度设三个重复。氟苯尼考给猪肌滓的药动学一药效学研究取一块９６孔微孔板，从第一孔至第十二孔各加入适宜灭菌液体培养基０．０５ｍＬ， 在无菌条件下吸取待测药液０．０５ｍＬ（５１２．００）Ｌｍ／ｇａ．其使，匀混中孔一第组各入加浓度为１２８．００９９／ｍＬ，从第－－ｊｆＬ吸取０．０５ｍＬ；０Ｈ入第三孔，如此倍比稀释至第十－－；ｆＬ， 十一孔弃去０．０５ｍＬ，第十一孔作为阴性对照孔，只加约物小加菌液，第十－４Ｌ作为阳性对照孔，只加菌液不加药。各孔分别加入１×１０‘＇ＣＦＵ／ｍＬ新鲜葡液０．０５ｍ［，，混匀．３７℃培养２４ｈ，观察各孔细菌生长情况，以目测法找出始变澄清的第一孔，该孔中所含药物浓度，即为ＭＩＣ，然后取高浓度液体培养物０．１ｍｌ接种于含小牛血清和ＮＡＤ的ＴＳＡ平板上，３７℃继续培养２４ｈ，以无菌落出现的最低药物浓度即为ＭＢＣ，每个浓度 设三个重复，连做三天。另设甲醇溶剂对照组。质控菌组菌株用大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２，质控药物为四环素。 ２．６．２杀菌曲线的制作抗菌药物浓度配制：依据ＭＩＣ实验结果，将氟苯尼考的储备液稀释为１／２ＭＩＣ、ｌＭＩＣ、２ＭＩＣ、４ＭＩＣ、８ＭＩＣ、１６ＭＩＣ、６４ＭＩＣ共７个系列浓度。菌悬液的制备：从培养平板上挑取单一菌落接种于１５ｍＬ含有小牛血清和ＮＡＤ的ＴＳＢ液体培养基中，于摇床（２００ｒ／ｍｉｎ，３７℃）上震荡培养６ｈ，将ＴＳＢ液体培养 基增菌的细菌做１０倍稀释成１０一、１０～、１０一、１０４、１０～、１０石、１０～、１０一、１０。９浓 度梯度。采用平皿表面计数法确定原菌液浓度，再用含有ＮＡＤ和小牛血清的ＴＳＢ 液体培养基稀释至２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ。菌落计数：受试菌液及不同系列浓度的氟苯尼考抗菌药物各１．５ｍＬ加入到无菌 细菌瓶中，此刻培养物中的细菌浓度分别为ｌ／４ＭＩＣ、１／２ＭＩＣ、１ＭＩＣ、２ＭＩＣ、４ＭＩＣ、８ＭＩＣ、３２ＭＩＣ（设置无药对照管一以１．５ｍＬ磷酸盐缓冲液代替不同系列浓度的氟苯 尼考药物），与Ｏ、１、２、４、８、１２、２４ｈ分别吸取０．１ｍＬ培养物，以无菌玻璃棒将 不同系列稀释度（１０倍稀释）的培养物均匀涂于含小牛血清和ＮＡＤ的ＴＳＡ培养平板上，３７℃孵育１８ｈ后进行菌落计数，并以不同时间点菌落数的常用对数绘制杀菌曲线。２．７氟苯尼考在猪血清和组织笼液中定量分析方法建立２．７．１色谱条件选择 色谱柱：Ｒｔｘ一５ ＭｅｔｈｙｌＳｉｌｏｘａｎｅ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ３０．０ｍ ｘ２５０９ｍ×０．２５ｐ．ｍｎｏｍｉｎａｌ载气：氮气（９９．９９９％）；恒压模式：Ｐ＝２０．００ｐｓｉ：进样体积：３９Ｌ；进样方式：不分流； 进样口温度：２５０℃；检测器温度：２７０℃。柱温：程序升温模式，初温：１５０℃，保１６华中农业人学２００８届顾｝：学位论文持１．０ｍｉｎ，升温速率：３０℃／ｍｉｎ，终温：２７０℃，保持１０ｍｉｎ。 ２．７．２样品制备 临用前室温下解冻血清和组织笼液，各取０．５ｍＬ置于１０ｍＬ离心管中，加入２ｍＬ乙酸乙酯，漩涡Ｙ昆匀，４０００ｒ／ｍｉｎ离一Ｌ，１０ｍｉｎ，趿上清液置于另一ｌＯｍＬ离心管中，重复提取一次．合并两次～卜清液，４０＂Ｃ下氮气吹干．２００１Ｍ。乙腈复溶，再加入１００１１［。ＢＳＴＦＡ，漩涡混匀，封ｎ，９０℃衍生２０ｍｉｎ，耿出回至室温，加入６００９Ｌ甲苯，混匀，再加入５００９Ｌ ＮａＯＩｔ，漩涡混匀，４０００ｒ／ｍｉｎ离，＇Ｌ，１０ｍｉｎ，取上层甲苯相进ＧＣ检测。２．７．３特异性和专一性考核空白样品５份和空白样品添加标准品后按样品前处理方法制备后检测，如果空白样品在氟苯尼考和氟苯尼考胺出峰时间附近无杂质峰干扰，药物与杂质分离良好，即说明方法的特异性和专一性良好。 ２．７．４最低检测限与定量限确定 取氟苯尼考和氟苯尼考胺标准贮备液适量，用乙腈稀释成浓度较低的系列混合标准溶液，对每种浓度测定５次，记录每次测得的信号强度Ｓ和背景信号强度Ｎ。重复操作５次。取２５次测定结果均值Ｓ和Ｎ，以达到Ｓ／Ｎ之３时样品的最低浓度为最低检测 限（ＬＯＤ）。 取空白血清和组织笼液，分别加入适量氟苯尼考和氟苯尼考胺标准溶液，使样 品中药物浓度在检测限附近，按样品前处理方法制备样品后供气相（ＧＣ）检测，每种浓度重复５次，每次５个重复。Ｓ烈芝３时对应浓度为样品最低检测浓度，Ｓ烈芝１０时对应浓度为样品的最低定量限（ＬＯＱ）。 ２．７．５标准曲线和工作曲线的绘制 准确吸取氟苯尼考和氟苯尼考胺贮备液适量，用乙腈稀释成浓度为５０９９／Ｌ，１ ００ｒｔｇ／Ｌ，２００Ｉ，ｔｇ／Ｌ，５００ｌｘｇ／Ｌ，１ ０００９９／Ｌ，２０００９９／Ｌ，４０００９９／Ｌ的标准工作液，每个浓度样品Ｎ５次，不同时间内重复上述操作５次，ＧＣ检测，将所得峰面积与对应浓度拟合，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。空白血清和组织笼液加入适量标准溶液，使得样品中药物浓度分别为５０９９／ｋｇ，１００１ｌｇ／ｋｇ，２００１上ｇ／ｋｇ，５００１ｘｇ／ｋｇ，１０００ｔｘｇ／ｋｇ，２０００９９／ｋｇ，４０００１上ｇ／ｋｇ，按照２．７．２进行样品处理，ＧＣ检测，每个浓度样品测定５次，重复５天，将所得峰面积与对应添加浓 度拟合，绘制曲线，求血清和组织笼液工作曲线回归方程和相关系数。２．７．６准确度和精密度测定１７准确腹剐精密慢川ｌ－』收率和变异系数曩弧，夺ｊ’Ｉｌｉｌｔｆ？ｉ羊¨组织娩ｉ在）ＪｉＩ八适蹴“硝溶液，使得ｌ札消和组织笼被ｒ睢０物浓度分别为１５９９／ｋｇ，３０９９／ｋｇ，６０９Ｎｋｇ，饭照２７ ２进｝＿ｒ样品处理，Ｇｃ检测，每个浓度样品删定５次，重缸５天ｔ¨算叫收宰和变异系数，２８猪组织笼感染模型的建立选取５ｍＬ颦料离心管．在其表卣打孔，Ｘ４Ｌ４Ｌ径Ｏ ３ｃｍ．蚓以０ｌｃｍ直彳±小儿．于５ｃｍ长的一段管上共打大扎４０～５０个，封闭离心管的，ｉＦ口端，打磨管擘使其表面光滑，ｊ‰崩前洗净并包扎火苗、烘干。图２－ｌ组织笼Ｆｉｇｕｒｅ ２－Ｉ Ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ选拌２０～２５ｋｇ的健壤仃猜，以盐酸普鲁｝…（０．０５％）进＿＝Ｊ＿局ｒＷ麻阱后，ｆｉ耳后州佛两侧皮肤以无阿手术分别切Ｊ Ｆ皮肤Ｊ１：；成２～３ｃｍ的小Ｉ ｆ．嚣出肌ｆ内，向ｒ玎钝眭分离肌Ｉ匀和皮肤，使ＩＢＬＩＳｉ和皮Ｊｂ瞳＿ｌｈｊ形成’个’≯腑，，然后植入组织蹙ｊｊ二缝俞圳１１ｆ见图２－２～２―７）。箨楮术Ｊ舌垤续?尤Ⅲ【肉汜射占露桑钠（１６０“啦ｆ丑，次）、链１００彝隶ｆｎ巾化／献），辞尺两次．局部缘以碘日ｆ．ｍ止协ｌＩ感染。删后拆线。阿周后以咒茼Ｔｆ＝身『器抽守纰彭ｌ笼内的组织砰片，血Ｊ＿＿４扁手术部位坫本恢复币渐ｔ组织 篷Ｌ被薄层结缔封１织包裹．其中充满翦邑、｝ｆｒ亮的组纵蹙淑（ＴｉｓｓｕｅＴＣＦ）， ｃａｇｅ Ｉｌｕｉｄ，２．９氟苯尼考在猪体内的药物动力学实验将成功建寺猜纽纵缝瞎染模型ＩＩｑ６儿猜分｝ｊＩ』编号称重，爻验前１２ｈ禁食，自ｉｈ饮 水。给药扁前８ｈｆ粜定动物以便采Ｉｆ『Ｌ．给鲥后１２ｈ内提＂｝饮水，１２ｈ订陡复ｌｆ‘常饲嘤。 Ｉｔ６头猪进行领部叭ｒ，ｑ注甜氟苯恺芍，给鲋删量为２０ｍｇ，ｋｇ体醇．给药前矗乏次空白㈨样．给药后．分别于１ ５、３０ｍｉｎ投１、１５、２、３、４、６、９、１２、１ ５、２４、３６、４８ｈ采血，每次采静脉血约４ｍＬ，置于离一Ｄ管巾，３０００“ｍｌｎ离－山１０ｍｉｎ＇）．ｔ＿离血清ｒ－２０℃冰箱ｆ朱存。厂――了Ｌ矧２－４植入组织笼Ｆｉｇｕｒｅ２－４ Ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ图２－３切口并钝性分离ｌ：罔２－５植入组织笼Ｆｉｇｕｒｅ ２－５ Ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ图２－６开始缝合Ｆｉｇｕｒｅ ２－６ｓｕｔｕｒｅ［：∑：翼√图２．７术后消炎Ｆｉｇｕｒｅ ２－７ Ｄｅｐｈｌｏｇｉｓｔｉｃａｔｅ组织蹙液样品（ＴＣＦ）在给药Ｉ绀最执卒向组织笼液．给曲后，分别Ｊ。Ｉ、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ从组织笼内舒刖抽取ｌ Ｏｍｌ．的组彭：笼液，置ｆ离心管中，混匀．３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取Ｉ‘清液，分两价ｊ：一２０℃冰箱悚存，进＂氟苯尼考冰度氟苯尼考给拼肌滓的药功学一药效学ｒｉ）ｆ＂Ｒ．的测定以及川接体内（ｅｘ ｖｉｖｏ）杀菌活力的测定。２．１０氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的间接体内（ｅｘ ｖｉｖｏ）杀菌活性研舅奄九 ２．１０．１猪胸膜肺炎放线杆菌的计数采用平板菌落计数法。将菌液进行１０～、１０～、１０一…１０倍递增稀释，然后分别 取不同稀释度的菌液０．１ｍＬ滴加于含有小牛血清和ＮＡＤ的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂 （ＴＳＡ）平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，每稀释度重复３块平板，３７。Ｃ温箱中培养 １８ｈ。统计平板上生长的活菌数，乘以稀释倍数，再乘以１０，即为每毫升菌液中所含 有的活菌单位数（ＣＦＵ／ｍＬ）。 ２．１０．２细菌的生长曲线测定 细菌在含有小牛血清和ＮＡＤ的ＴＳＢ液体培养基中连续培养１４ｈ，每１ｈ采取０．１ｍＬ细菌悬液，进行细菌计数。以菌数的对数值为纵坐标，培养时间为横坐标，作生长曲线。 ２．１０．３氟苯尼考８，０ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌动力学曲线测定 确定１０个血清样品（０、ｌ、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ）的间接体内（ｅｘ ｖｉｖｏ） 杀菌活性即将对数生长期菌液培养过夜后用ＴＳＢ液体培养基稀释至３×１０７ＣＦＵ／ｍＬ， 然后每一个血清样品ｌｍＬ分别加入１０¨Ｌ该浓度菌液中，混匀后立即置于３７℃培养箱 中培养，分别于０、１、３、６、１２、２４ｈ取０．１ｍＬ培养液进行细菌计数（重复３次取平均 值）。以各时间点ＣＦＵ／ｍＬ值的常用对数为纵轴，以孵育时间（ｈ）为横轴，绘出不 同浓度下氟苯尼考的间接体内杀菌动力学曲线。同理，确定１０个组织笼液样品（０、１、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ）的间接体内（ｅｘ ｖｉｖｏ）杀菌活性即将培养过夜的对数生长期菌液，用ＴＳＢ液体培养基稀 释至３×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，然后每一个组织笼液样品０．３５ｍＬ力Ｈ入５ｐ．Ｌ该浓度菌液中，以下 方法同上，建立起各组织笼液样品中氟苯尼考的间接体内杀菌动力学曲线。２．１１氟苯尼考在猪血清和组织笼液的ＰＫ．ＰＤ关系的建立２．１１．１数据处理 药动学公式：消除半衰期：Ｔｌ／２Ｋｂ＝０．６９３／Ｋｂ（Ｋｂ：消除速率常数） 吸收半衰期：ＴＩ／２Ｋａ＝０．６９３／Ｋ。（Ｋ。：吸收速率常数） 总体清除率：ＣＬ＝ＫｂＶｄ（Ｋｂ：消除速率常数，Ｖｄ：表观分布容积）２０华中农业大学２００８扁硕｝学位论文ＡＵＣ＝Ａ（Ｉ／Ｋｂ?Ｉ／Ｋａ）Ｃ＝Ａ（ｅ。鼬‘．ｅ－Ｋａｔ）Ｃｍａｘ＿ＦＸｏｅ－Ｋｂｌｍ鼍Ｖ）使用门Ｔ‘…Ｉ方程又称Ｓ型Ｅｍ８ｘ模型处理ｅｘ．ｖｉｗ，Ａ！ｒＣ２１ｈ爪ｌｌＣ值与抗菌疗效（病 原菌数目的减少）之间的关系，此模型公式为：Ｅ＝Ｅ獬毒Ｃ：ｆ（ＥＣ姜｝Ｃ：、Ｅ为病原菌数量（对数值）的减少，Ｅｍａｘ为空白样品中病原菌培养２４ｈ后的增 量；Ｃｅ为ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ值；ＥＣ５０为Ｅｍａｘ一半时ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ值；Ｎ为Ｈｉｌｌ 系数，决定ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ．ｅｆｆｅｃｔ关系的斜率（Ｓ型曲线关系的陡度）。当Ｅ＝０ 时没有抑菌效果，当Ｅ＝．３时可以杀灭９９．９％的细菌。Ｈｉｌｌ模型数据处理可使用ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ软件（ＳＣＩＩｎｃ）。２．１１．２Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ＣｏｎｓｕｌｔａｎｔｓＰＫ．ＰＤ参数临界点值（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）的确定ｖｉｖｏ通过Ｈｉｌｌ模型建立起的ｅｘＡＵＣ２４ｈ／ＩＶＩＩＣ值与抗菌疗效之间的关系，确定ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ的临界值（抑制、杀灭、彻底清除病原菌）。 ２．１１．３给药方案的预测 通过Ｈｉｌｌ方程可知血清刚开始起到抑菌效果时的ｅｘ 除病原菌的ｅｘｙｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ值和彻底清ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／１ⅥＩＣ值，代入公式：ｄ×ｔａｒｇｅｔｔｅｄＡＵＣ２４＾／ＭＩＣ（ｅｘ ｖｉｖｏ）Ａ ＵＣ２４＾／ＭＩＣ（ｉｎｖｉｖｏ）Ｘ为药物用量（ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）；ｄ为氟本尼考药动学用药剂量，即可得到临床起到 抑菌效果的最佳给药剂量范围。２１氟苯尼考给猜肌注的药动学一药放学研究３结果３．１氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌效果氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌最低抑菌浓度ＭＩＣ为Ｏ．５．ｔｔｇ／ｍＬ，最低杀菌浓度ＭＢＣ为ｌｐｇ／ｍＬ（表３―１），表明氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌有很强的杀菌活性。 表３．１氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌效果Ｔａｂｌｅ ３－１ Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ试验 次数●ｌ氟苯尼考浓度（１ｘｇ／ｍＬ）礤 ８鲋勉坫８４２●吣５吆 ２性照 眦郴一 一．一 一 一一 一 一～ 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一一＋ ＋ ＋一 一性昭～－Ｌ一－一 一ｍ凇＋＋ 卜＋ 一－最抑浓 低菌度一一一一 一ｌ ２一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一一 一 一＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋一 一 一＋ ＋ ＋最杀浓 低菌度３注“一”表示无肉眼可见的细菌；“４－”表示有肉眼可见的细凶Ｎｏｔｅ：“――”ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ；“４－’’ｂａｃｔｅｒｉａ ｇｒｏｗｉｎｇ１０８――●一ｃｏｎｔｒｏｌ―＿．卜１１４ＭＩＣ６１１２ＭＩＣ一一ｌＭＩＣ―．－－一２ＭＩＣ一．［高＼，譬一笤＿［４―－●一４ＭＩＣ―．－一８ⅡＩＣ ．?－－－?－一３ ２ＭＩＣ２０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ｔｉｍｅ（ｈ）图３．１氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线Ｆｉｇｕｒｅ ３－ＩＴｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｉｌｕｓ牛中农业大学２００８届硕ｌｊ学位论文从图３．１可以看到随着浓度的增加，氟苯尼考杀菌时间相应的缩短，杀菌程度增加，呈现了浓度依赖的特征，并且在４ＭＩＣ处未达到饱和状态，随着浓度的继续增加， 杀菌活性继续增大，据此判断氟苯尼考为浓度依赖性杀菌药物。３．２定量分析方法学结果３．２．１特异性和专一性空白样品和添加药物的样品色潜图（图３．２），从色谱图上可看到在本实验选定的分离条件下，待测物附近没台干扰峰，药物与样品杂质分离良好，峰形对称尖锐。方法的特异性和专一性良好，能够满足分析的要求。Ｈ №肥∞∞ ∞∞ｍ∞３ ２∞ ∞ ∞ ∞１∞ ∞０１吣 ∞ｏ砌∞ｏ 把№ ∞∞ ｛寻 ∞伸∞｜ｌ ０ 瑚０啪００ｏ伽０Ⅷ∞图３．２血清和组织笼液中氟苯尼考和氟苯尼考胺色谱图 Ａ：血清空白；Ｂ：添加药物的血清；Ｃ：组织笼液空白；Ｄ；添加药物的组织笼液Ｆｉｇｕｒｅ ３－２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ Ｆｉｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｎｄ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｍｉｎｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄ Ａ：Ｂｌａｎｋ ｓｅｒｕｍ；Ｂ：Ｓｅｒｕｍ ｓｐｉｋｅｄ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇｓ（１５ｐｇ／Ｌ） Ｃ：Ｂｌａｎｋ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄ；Ｄ：Ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄ ｓｐｉｋｅｄ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇｓ（１５ｐｇ／Ｌ）３．２．２最低检测限和最低定量限氟苯尼考和氟苯尼考胺在血清和组织笼液中的最低检测限和最低定量限均分别为ｌＯｐ班和１５Ｉｔｇ／Ｌ。３．２．３标准曲线和工作曲线氟苯尼考给猪肌沣的药动学一药放学研究由图３．３可知氟苯尼考胺和氟苯尼考在５０¨ｇ瓜ｇ－－一４０００ｐｇ／ｋｇ浓度范围内线性关系 良好（ｒ＝Ｏ．９９９９）：氟苯尼考胺和氟苯尼考的标准曲线回归方程分别为ｙ＝ｌ １６．６５ｘ＋８５Ｏ Ｏ ０ ０ Ｏ ４ ４１２．９４年Ｄｙ＝６５．９ｘ一４９８．０７。５００ ０ ０ ０ ０ ０００ Ｏｆｕ００＾ｕ３＾Ｊ０ Ｏ＾ｕＯＯ２ ５０ ０ ０ ０２０ ０ ０Ｄ０１５ ０ ０ ０ ０ １００ ５００ ０ ０ ００ ０ ００ ５００ １ ０００ １ｂ００ Ｚ０００ Ｚｂ００ Ｊ０００ 摹ｂ００ ｑ０００ ｑｂ００图３．３氟苯尼考胺和氟苯尼考标准曲线图Ｆｉｇｕｒｅ ３－３ Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｎｄ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｍｉｎｅ血清和组织笼液中氟苯尼考胺和氟苯尼考浓度在５０“ｇ／Ｉ（ｇ～４０００肛ｇ／ｌ（ｇ范围内各 浓度与其响应值（峰面积）成线性关系，对浓度（Ｘ）与响应值（Ｙ）进行回归分析， 得到回归方程。氟苯尼考胺和氟苯尼考的回归方程见表３．２。表３．２各样品中氟苯尼考和氟苯尼考胺工作曲线Ｔａｂｌｅ ３．２ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｎｄ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｍｉｎｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ药物名称 氟苯尼考胺样品 血清 组织笼液线性范围（扯ｇ他ｇ）５０～４０００５０＂－＇４０００回归方程Ｙ＝Ｉ ０１．３２Ｘ．９４３．８３相关系数（ｒ）０．９９８２Ｙ＝１００．７９Ｘ＋２９３１．１０．９９８ｌ氟苯尼考血清 组织笼液５０～４０００Ｙ＝６２．４３２Ｘ．３０５０．７０．９９８５５０～４０００Ｙ＝６０．９２６Ｘ．２ １１ ６．６０．９９９２３．２．４准确度和精密度氟苯尼考胺和氟苯尼考在血清和组织笼液中的提取回收率与日间相对标准偏差见表３．３。结果表明，当血清中分别添加氟苯尼考和氟苯尼考胺浓度为１５Ｉｔｇ／Ｌ、３０肛ｇ／Ｌ 和６０ｐｇ／Ｌ时，氟苯尼考回收率为８４％～８６％，日间相对标准偏差为５％～６％，氟苯尼 考胺回收率为８３％＇－＇９１％，日间相对标准偏差为６％～７％；当组织笼液中分别添加氟２４华中农业人学２００８届硕Ｉ：学位论文苯尼考和氟苯尼考胺浓度为１５１ａｇ／Ｌ、３０ｒｔｇ／Ｌ和６０－ｔｇ／Ｌ时，氟苯尼考回收率为８３％～８５％，日间相对标准偏差为５％～６％，氟苯尼考胺回收率为８ １％～９０％，同间相对标 准偏差为６％；符合分析方法国家标准对准确度和精密度的要求。 表３．３氟苯尼考和氟苯尼考胺在血清和组织笼液中的回收率和变异系数（ｎ＝５）Ｔａｂｌｅ ３－３ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ａｎｄ ＲＳＤ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｎｄ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｍｉｎｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ（ｎ＝５）氟苯尼考胺１５ ３０ ６０８３士５ ８３士４ ９１－４－６８１＋５ ８４＋５ ９０士６氟苯尼考１５ ３０ ６０８４＋５ ８２土４ ８６＋４８５士５ ８３＋４ ８５＋４３．３氟苯尼考在猪血清中和组织笼液中的药物动力学参数表３－４猪肌注氟苯尼考（２０ｍｇ／ｋｇ）后的药动学参数（平均值４－标准差ｎ＝６）Ｔａｂｌｅ ３－４ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ｍｅａｎ４－ＳＥＭ，ｎ＝６）ａｆｔｅｒ ＩＭ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ注：‘‘＿＇’表示没有这个参数。Ｎｏｔｅ：：‘Ｌ―』’ｎｏ ｐａｒａｍｅｔｅｒ．血清和组织笼液中氟苯尼考的药物代谢动力学参数见表３．４。猪肌注氟苯尼考后 的血药经时过程和组织笼液经时过程均符合一室开放模型（图３．４）。血清中氟苯尼２５氟苯尼考给ｌｆｆ肌注的药动学一药故学研究考的吸收很快，平均吸收半衰期Ｔｌ／２Ｋ。为１．５＋０．７６ｈ，在２．００ｈ时达到最大血药浓度为 ５．９３－４－１．６３ｐ，ｇ／ｍＬ，其消除半衰期Ｔｌ，２Ｋｈ为１１．１６＋３．３６ｈ， 曲线下面积ＡＵＣ为２４．７６ａ：５．３６ｈ＊ｌ，ｔｇ／ｍＬｊ氟苯尼考在血清中清除很快，其清除率ＣＬ为１．０５３士０．３１Ｌ／ｈ／ｋｇ。氟苯尼考渗入组织笼中的速度很慢，具穿透半衰期７ｌ＇ｌ／２Ｋｐｅｎ为４．６２士１．１９ｈ，在组织 笼中氟苯尼考的浓度在１２．００ｈ时达到最大浓度为３．２０－士０．８９．ｕｇ／ｍｌ。。组织笼液中氟苯尼 考的消除半衰期为１７．３５士０．５７ｈ，约为血清中氟苯尼考的消除半衰期的２倍（血清中氟 苯尼考的消除半衰期为１１．１６土３．３６ｈ）。组织笼液的ＡＵＣ值（４９．０９土７．０４ｈ木ｌｓｇ／ｍＬ）约 为血清的ＡＵＣ值（２４．７６士５．３６ｈ＊ｐ，ｇ／ｍＬ）２倍。但组织笼液的Ｃｍａｘ４，于血清，其在１２．００ｈ 才达到最大Ｃｍａｘ为３．２０－士０．８９ｐ，ｇ／ｍＬ（血清中最大Ｃｍａｘ为５．９３－４－１．６３ｐ，ｇ／ｍＬ）。氟苯尼 考在组织笼液中清除很慢，其清除率ＣＬ为０．４８２士０．１ １Ｌ／ｈ／ｋｇ。组织笼液中氟苯尼考的 浓度从６ｈ之后一直高于血清中氟苯尼考的浓度（图３．４）。１０＾｛∞ｉ、一，越蟮斟Ｐ黜．臁０．０１ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０时间（ｈ）图３．４猪肌注氟苯尼考（２０ｍｇ／ｋｇ）后在组织笼液和血清中的药物浓度一时间对数图Ｆｉｇｕｒｅ ３－４ Ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｔｉｍｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌｃｕｒｖｅａｆｔｅｒＩＭ３．４氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌活性３．４。１细菌生长规律 生长曲线表明，细菌的对数生长期约持续４ｈ，然后逐渐过渡到稳定生长阶段，此时的活菌数最高且维持稳定，约持续３ｈ，第８ｈ后细菌的生长曲线呈现明显的下滑 趋势，处于衰亡期（图３．５）。２６华中农业大学２００８届硕卜学位论文２０１８一、１５－｜ Ｅ１Ｏ１４肇ｉ２ 浆 镪１０８６ ４ ６ ８ １０ １２ｔ４１６培弊时问Ｃｈ）图３．５猪胸膜肺炎放线杆菌的生长曲线Ｆｉｇｕｒｅ ３－５ Ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ３．４．２氟苯尼考的ｅｘ ｖｉｖｏ杀菌动力学特点 血清中氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的间接杀菌活性共取了１０个点时的药物 浓度即给药后的０、１、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ（它们的平均药物浓度分别 为０、２．９２１ａｇ／ｍＬ、３．７３９９／ｍＬ、０．９３１．ｔｇ／ｍＬ、０．６１９９／ｍＬ、０．３８扯ｇ／ｍＬ、０．２４“ｇ／ｍＬ、Ｏ．１５“ｇ ／ｍＬ、０．０５９９／ｍＬ、Ｏ．０２９９／ｍＬ），从图３－６可知：１、３、６ｈ氟苯尼考有很强的杀菌活性， 孵育２４ｈ后几乎所有的细菌都被杀死，９ｈ时氟苯尼考有较弱的抑菌活性，而１２、１５、 ２４、３６、４８ｈ的氟苯尼考没有抑菌活性。组织笼液中氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的间接杀菌活性取了同样的１０个点时的药物浓度即给药后的０、ｌ、３、６、９、１２、１５、２４、３６、４８ｈ（它们的平均药物 浓度分别为０、０．３９９／ｍＬ、０．６６“ｇ／ｍＬ、１．１ ｌｇｇ／ｍＬ、２．１ １１．ｔｇ／ｍＬ、３．２Ｉｒｔｇ／ｍＬ、１．７９９９／ｍＬ、 Ｏ．８５ｐ，ｇ／ｍＬ、０．４１．ｔｇ／ｍＬ、Ｏ．１５ｌ，ｔｇ／ｍＬ），从图３－７可知：在６、９、１２、１５、２４ｈ氟苯尼考 有很强的杀菌活性，孵育２４ｈ后几乎所有的细菌都被杀死，３ｈ的氟苯尼考有较弱的抑 菌活性，而１、３６、４８ｈ的氟苯尼考没有抑菌活性。 肌注氟苯尼考（２０ｍｇ／ｋｇ）后，血清中氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的 ＡＵＣｏ－ｊＭＩＣ和ＡＵＣｏ．。ＡＭＢＣ分别为４１．８４和２０．９２（平均ＡＵＣｏ。为２０．９２ ｈ＊ｇｇ／ｍＬ，ＭＩＣ为０．５ｐ，ｇ／ｍＬ，ＭＢＣ为ｌｇｇ／ｍＬ），而组织笼液中氟苯尼考对猪胸膜肺炎的ＡＵＣｏ．卅ＶＩＩＣ和ＡＵＣｏ√ＭＢＣ分别为１２４．７３和６２．３６（ＡＵＣｏ。为６２．３６ｈ＊ｐ，ｇ／ｍＬ，ＭＩＣ为０．５１ａｇ／ｍＬ，ＭＢＣ为ｌＩ．ｔｇ／ｍＬ），血清中氟苯尼考药物浓度超过ＭＩＣ和ＭＢＣ的时间分别为７．９２士３．Ｏｈ 和４．４２士１．１５ｈ，而组织笼液中氟苯尼考药物浓度超过ＭＩＣ和ＭＢＣ的时间分别为氟苯尼考给狮肌注的药动学一药效学研究２２．５＋５．６ｌｈ币［１９．５＋４．８Ｉｈ，组织笼液中氟苯尼考药物浓度超过ＭＩＣ的时间大于血清。血清中氟苯尼考对猪胸膜肺炎的Ｃｍａｘ／ＭＩＣ和Ｃｍａｘ／ＭＢＣ分别为８．５３士２．１６和４．２６士１．０８，组织笼液中氟苯尼考对猪胸膜肺炎的Ｃｍａｘ／ＭＩＣ和Ｃｍａｘ／ＭＢＣ分别为４．０５士１．２５和 ２．０２－＋－０．６２（表３．５）８６＾．【暑≈０１）籁馋捆４２０ ０ ５ ｉ０ ｉ５ ２０ ２５ ３０孵育时间ＱＬ）图３－６血清中氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的间接杀菌活性Ｆｉｇｕｒｅ ３－６ Ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉＵｕｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ８６＾一Ｅ、。１）薪姥姆４２０ ０５１０１５２０２５３０孵育时间ｍ）图３．７组织笼液对猪胸膜肺炎放线杆菌的间接杀菌活性Ｆｉｇｕｒｅ ３－７ Ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅ ｆｌｕｉｄｓ２８华中农业人学２００８届硕卜学位论文表３．５肌注氟苯尼考后的体内ＰＩＧＰＤ参数值（平均值４－标准差，ｎ＝６）Ｔａｂｌｅ ３－５ Ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＩＧＰＤｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ｍｅａｎ ４－ＳＥＭ，ｎ＝６）ａｆｔｅｒ ＩＭＦｌｏｆｆｅｎｉｃｏｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ注：‘‘Ｊ’表不没百单位。Ｎｏｔｅ：：‘‘－＿，’：ｎｏ ｕｎｉｔ．血清中和组织笼液中氟苯尼考体内平均ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ和ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ及平均间接体外杀菌活性ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ和ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ值见表３－６。体内ＡＵＣ２４ｈ／ｌⅥＩＣ和 ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ值通过测定肌注氟苯尼考后体内ＡＵＣ２４ｈ值除以体外测定的ＭＩＣ和ＭＢＣ值所得。平均间接体外杀菌活性ＡＵＣ２４ｈＭＩＣ和ＡＵＣ２４ｈＭＢＣ值通过预定时间点采集血清和组织笼液中氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌培养２４ｈ后ＡＵＣ２４ｈ值除以体外测 定的ＭＩＣ和ＭＢＣ值所得。血清中平均间接体外杀菌活性ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ在６ｈ时值为２５．４６，孵育１２ｈ后已经足够全部杀灭细菌，６ｈ时氟苯尼考的浓度为０．９３１．ｔｇ／ｍＬ，约为 ＭＩＣ的２倍。９ｈ时的ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为２２．１９，孵育２４ｈ后只有很弱的杀菌活性。１２ｈ时 ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为１０．３５，孵育２４ｈ后没有抑菌活性，说明要想杀灭所有细菌，ＡＵＣｚ４ｈ／ＭＩＣ 至少应为２２．１９。组织笼液中平均间接杀菌活性ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ在６ｈ时值为５４．６３，孵育１２ｈ后已经足 够全部杀灭细菌，６ｈ时氟苯尼考的浓度为１．１ １¨，ｇ／ｍＬ，约为ＭＩＣ的２倍，３ｈ时ＡＵＣ２４ｈ／Ａ／［ＩＣ为２３．７４，孵育２４ｈ后具有较弱的杀菌活性，３６ｈ时ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为５．７０，孵育２４ｈ后没有抑菌活性，说明要想杀灭所有细菌，ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ至少应为２３．７４。表３．６氟苯尼考的ｉｎ ｖｉｖｏ和ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ，ＭＩＣ和ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ值（ｎ＝６） Ｔａｂｌｅ ３－６ Ｅｘ ｖｉｖｏ ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ａｎｄ ＡＵＣ２４ｈ／］Ｖ［ＢＣ（ｎ＝６）ａｆｔｅｒ ＩＭ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＦｌｏｒｆｅｎｉｔ－ｏｌｏｆ血清 氟苯尼考体内ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ（ｈ） 和ＡＵＣｚ４ｈ．－／ＭＢＣ（ｈ） ＡＵＣ２ａｈ／ＭＩＣ ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ 氟苯尼考间接体外 ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ（ｈ）ｌ ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ８０．９３士５．９０ ４２．５９士１ Ｏ．０６ ２５．４６ｊ：３．１６ ２２．１９＋１．６４ １０．３５＋０．９９ ３．５ １士０．７０ １．５６士Ｏ．４３ Ｏ．８５士１．３ｌ ０．３３士Ｏ．６５ ４３．２８士５．６９ ２６．９８士３．６４组织笼液６９．６４＋４．３２ ３８．４７士５．３４４．０２士１．３２ ２３．７４－４－３．３９ ５４．６３士１ ０．５６ ６９．６２＋１ ７．３３ ７１．５５＋１８．１０ ６４．２９土ｌ ４．４９ ３８．７１士６．２０ ５．７０士２．３ １ １。３４士１．８８３ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ６ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ９ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ１ ｌ２ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ５ｈＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ２４ｈＡＵＣ２４ｈ／Ｍ［Ｃ ３６ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ４８ｈ－ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ 氟苯尼考间接体外 ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ（ｈ）ｌ ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ４０．４７士２．９５ ２１．３０士５．０３ １２．７３士１．５８ １１．１０士Ｏ．８２ ５．１ ８＋０．５０ １．７６士Ｏ．３５ １．６６＋０．７６ ０．７９士１．６５ ０．４７士０．８２１．８８士０．６７ １１．８７士１．７０ ２７．３１士５．２８ ３４．８ １４－８．６７ ３５．７７士９．０５ ３２．１ ４－４－７．２４ １９．３５士３．１０ ３．２２士１．２４ １．４９士０．８７３ｈ?ＡＵＣ２４ｈ］ＭＢＣ６ｈ－ＡＵＣ２４ｈ／～ＩＢＣ９ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ１ ２ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ ｌ５ｈＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ２４ｈＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ ３６ｈ―ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ ４８ｈ．ＡＵＣ２４ｈ／ＭＢＣ华中农业大学２００８届硕｝学位论义３．５氟苯尼考在猪血清和组织笼液的ＰＫ．ＰＤ模型的建立通过采用ＷｉｎＮｏｚｌｌｉｎ软件对药动学和药效学数据拟和知氟苯尼考在猪体内的 ＰＫ，ＰＤ模型为Ｓ形ＥｍａＸ模型即Ｈｉｌｌ模型。通过Ｈｉｌｌ方程处理ｅｘ ｖｉｖｏＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ值与抗菌疗效之间的关系（表３．７）。结果表明，血清中当ＡＵＣ２４ｈＭＩＣ为２３．６９时，开始有抑菌作用，ＡＵＣ２４ｄＭＩＣ为２４．３３时能抑制５０％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为２５．９６时能抑 ￥Ｊ］９９．９％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｈ／ｌ＇ｌｖｉｌＣ为５２．３３时能够彻底清除病原菌的生长。组织笼液 中当ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为２０．１３时开始有抑菌作用，ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为２２．３６时能抑Ｎ５０％的细 菌生长，ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为２６．３４时能抑￥１１９９．９％的细菌生长，ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ为５１．６４时能够彻底清除病原菌的生长。可以看到血清和组织笼液没有太大的差别，说明血管和非 血管中液体杀菌没有太大差别。从表３．７可知，抑菌和杀菌ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ比较接近，但彻底清除病原菌ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ几乎是抑菌和杀菌ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ的两倍。表３－７肌注氟苯尼考（２０ｍｇ／ｋｇ）后血清和组织笼液中ＰＫ．ＰＤ关系Ｔａｂｌｅ ３－７ ＰＫ－ＰＤ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｇｅｆｌｕｉｄ（ｎ＝６）ａｆｔｅｒ ＩＭａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ（２０ｍｇ／ｋｇ）根据公式ｘ：堡型竺望丝竺丝警圣巡！竺．堕竺！可知当Ａｕｃ２４ｈ／ＭＩｃ（ｅｘＡＵＣ２４＾／ＭＩＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ）…ｖｉｖｏ）为２３．６９时临床开始有抑菌效果（ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ）为４３．２８），代入方程得 Ｘ＝ＩＯ．９５ｍｇ依ｇ即临床最低给药剂量应为１０．９５ｍｇ／ｋｇ，当ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ（ｅｘ ｖｉｖｏ）为５２．３３ 时临床能够彻底清除病原菌（ＡＵＣ２４ｈ／ＭＩＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ）为４３．２８）代入方程得 Ｘ＝２４．１８ｍｇ／ｋｇｌｉＯ临床最高给药剂量为２４．１８ｍｇ／ｋｇ。根据ＰＫ．ＰＤ模型可以求得任意时氟苯尼考给猪肌注的药动学一药效学研究刻抑菌效果所需的给药剂量，从而为临床更好的用药提供参考，避免滥用药物造成药物残留和细菌耐药。３２华中农业大学２００８届硕卜学位论文４讨论４．１猪胸．１ｊＯ吴＇：１士胛１：１４－炎放线杆菌的保存微牛物具有容易变异的特性．所以在保藏过程中，一定要使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时ｆＢＪ内使其不发生变异而又保持活力。 低温干燥和隔绝空气足使微生物代谢能力降低的重要因素。对于猪胸膜肺炎放线杆菌，长期保存用１５％的脱脂奶粉冷冻干燥保存，短期保存可以用１５％～３０％的甘油 冻存。４．２氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌杀菌活性药敏实验的方法很多，有Ｋ．Ｂ琼脂扩散法，肉汤稀释法等。Ｋ．Ｂ法只能定性，并且所用时间长，不能及时报出药敏结果，无法计算出抗生素的使用剂量。而微量稀 释法定量，可以补充Ｋ．Ｂ琼脂扩散法的不足，通过微量稀释法定量测定抗生素对菌 株的ＭＩＣ，能加速药敏试验，并为临床医师用药提供快速、客观的参考依据。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种高度接触传染性呼吸 道疾病，目前，市场上有大量用于治疗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌药物，但大部分 药物因大量和长期使用而导致效果欠佳。何启盖等（２００３）通过纸片法测定猪胸膜肺炎放线杆菌对１４种抗生素的敏感性， 通过测定抑菌圈大小可知猪胸膜肺炎放线杆菌对大多数抗菌药都不敏感，但对氯霉素较敏感，而氟苯尼考的抑菌活性强于氯霉素，所以猪胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼 考应该敏感。Ｓｈｉｎ等（２００５）以８１株猪胸膜肺炎放线杆菌、５０株猪多杀性巴氏杆菌、 ７０株猪支气管败血波氏菌和４２株牛溶血性曼氏杆菌（２４３株均为１９９８－－－－２００３年之间临床分离的）为测试菌株，用琼扩法进行了氟苯尼考等８种抗菌药的敏感性试验，结果发现，只有２株猪支气管败血波氏菌对氟苯尼考耐药。除猪支气管败血波氏菌的ＭＩＣ、ＭＩＣ５０和ＭＩＣ９０分别为１．０～４．０、１．０和２．０“∥ｍＬ外，氟苯尼考对其余包括巴氏杆菌在内的等几种病原菌ＭＩＣ＜ｌｇｇ／ｍＬ，ＭＩＣ５０和ＭＩＣ９０均为０．５１ｘｇ／ｍＬ。本试验测定氟苯 尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）和最小杀菌浓度（ＭＢＣ）分别 为０．５｝ｔｇ／ｍＬ和１“ｇ／ｍＬ，与Ｓｈｉｎ等的研究结果相符，证明猪胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考敏感，并且氟苯尼考具有高效、低毒、在体内分布广泛等优点，是治疗猪胸膜 肺炎放线杆菌的首选药物。氟苯尼考不溶于水，而溶于甲醇和乙腈等有机试剂，而有机试剂本身有一定的氟苯尼考给猪肌沣的药动学一药效学研究杀菌作用。本实验所用的是甲醇溶剂，为了证明甲醇溶剂对氟苯尼考的抑菌效果有 无影响，将甲醇纯试剂与氟苯尼考含量为１０２４ｐｇ／ｍＬ的甲醇溶液，按相同稀释倍数稀释成不同浓度作对照实验，结果表明甲醇稀释至氟苯尼考含量为１２８．ｔｔ∥ｍＬ的相同 倍数时没自抑曲效果，而本实验所删氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓 度（ＭＩＣ）为０．５ｐｇ／ｍ［。，显然甲醇对氟苯尼考的抑蔚效果无影响。国外在对抗菌药物浓度与杀菌效果之间关系的研究中，将抗菌药物根据杀菌活 性的方式分类。大致可将其分为浓度依赖性、时间依赖性及与时间有关但ＰＡＥ较长 者三类（钟诗龙等，２００３；王睿，２００２），该分类为不同药物给药方案优化设计提供了重要的理论意义。浓度依赖性抗菌药物的ＰＫ．ＰＤ参数是ＡＵＣ／ＭＩＣ和Ｃｍａｘ／ＭＩＣ，而时间依赖性抗菌药物的ＰＫ．ＰＤ参数是Ｔ）ＭＩＣ。 浓度依赖性（时间独立性）抗菌药物的特征是在较大的浓度范围内，随着浓度的增加，杀菌速度和程度也增大，并且抗生素后效应倾向于被延长，这一延长倾向也与其浓度相关。非浓度依赖性（时间依赖性）抗菌药物的特征是一旦其浓度达到一个阈值，即使再增加浓度，杀菌速度和程度也保持相对稳定。这个杀菌活性的饱 和状态通常产生于ＭＩＣ的低倍数（４＂－＇－－５倍）处。朱曼等（２００４）通过做甲磺酸加替 沙星等三种抗菌药物的体外杀菌作用研究，通过杀菌曲线证明加替沙星和阿米卡星 为浓度依赖性药物，其杀菌活性随着浓度的增加不断增强，而哌拉西林钠为时间依 赖性药物其杀菌活性在浓度为４ＭＩＣ时达到饱和，再增加药物浓度，杀菌活性并没 有明显增长。氟苯尼考的杀菌曲线实验方法和朱曼等所用方法一样，从氟苯尼考不 同系列ＭＩＣ对猪胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线结果可见，氟苯尼考和加替沙星及阿 米卡星一样显示了明显的浓度依赖性杀菌特点，其杀菌程度随着药物浓度的增加而 增强，表明氟苯尼考属于浓度依赖性抗菌药物。其ＰＫ．ＰＤ参数和加替沙星及阿米卡星一样应该是ＡＵＣ／ＭＩＣ和ＣｍａｘＪＭＩＣ，其对致病菌的杀菌作用主要取决于峰浓度，而与作用时间关系不密切，其随着浓度的增加，杀菌率和杀菌程度增大，可以通过 提高Ｃｍａｘ来提高临床疗效，但不能超过最低毒性剂量。该结论有助于理解氟苯尼考杀菌效果与临床适用药物浓度的关系，因此可以为针对特定的病原菌给予最佳的特定抗菌药物提供科学依据，为给药方案优化设计的 研究提供了理论依据。４．３定量方法学选择依据定量方法研究采用配备有电子捕获检测器（ＥＣＤ）的气相（ＧＣ）方法，是因为华中农业大学２００８届硕士＝学位论文氟苯尼考属于氯霉素类抗菌药，这类抗菌药分子结构的特殊性在于分子结构中有电负性强的卤素原子，而氟原子的电负性更强，在ＥＣＤ上有比较强的响应信号，但由于分子中有极性比较大的基团，挥发性比较差，因此需要在检测前衍生化，生成挥 发性高的样品，一定条件下分离后，冉用ＥＣＤ检测。根据药物分子结构和ＧＣ法衍生化的理论基础．衍生反席采用的是硅烷化反应。 试剂是ＢＳＴＦＡ。分子结构中的羟基被硅烷化，生成易挥发的、稳定的酯，并且不破坏分子结构巾的氟原子，然后进行检测。 ４．３．１色谱柱的选择氟苯尼考和氟苯尼考胺的衍生产物极性低，在高温下容易气化，在弱极性的 ＨＰ．１和ＲＴＸ．５毛细管柱上保留适当、峰形对称尖锐。柱子的选择主要是根据“相似 相溶”原理，另外这两根柱子具有不易氧化、高效、使用温度高和寿命长等优点，适合组织样品中痕量成分的分离。ＨＰ．１和Ｒ}