文昌鱼4.1蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结合活性中心的鉴定--《中国海洋大学》2012年硕士论文
文昌鱼4.1蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结合活性中心的鉴定
【摘要】：红细胞特殊的细胞形态需要具有独特蛋白骨架网的膜结构来维持。该蛋白骨架网的主要组分包括：血影蛋白、肌动蛋白、4.1蛋白和锚蛋白等。其中4.1蛋白和锚蛋白提供了膜骨架与跨膜蛋白之间的连接。脊椎动物4.1蛋白有四个高度保守的类型：4.1R、4.1N、4.1G、4.1B。其中4.1R蛋白是最早在红细胞中发现的4.1蛋白家族成员，被认为是4.1蛋白家族的原型。脊椎动物中的四种4.1蛋白含有相同的结构域：FERM、FA、SAB和CTD结构域。在无脊椎动物中也发现有类4.1蛋白，它通常由一个基因编码，并且结构域组成中缺少SAB结构域。脊椎动物4.1R蛋白的SAB结构域的功能是与血影蛋白和肌动蛋白结合，那么无脊椎动物中的4.1蛋白是否具有与血影蛋白和肌动蛋白结合的功能呢？还有SAB结构域是如何进化而来的呢？这些问题尚不清楚。
文昌鱼属于头索动物，处于无脊椎动物和脊椎动物之间，是研究脊椎动物进化和起源的模式动物。本实验室已经在文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中克隆得到4.1蛋白基因（BjP4.1），发现它与其他无脊椎动物类4.1蛋白一样缺少SAB结构域，但其体外表达重组蛋白，能够与血影蛋白和肌动蛋白结合。我们通过ELISA分析实验表明，人类4.1R和文昌鱼BjP4.1蛋白与血影蛋白和肌动蛋白的结合能力相近。为了研究对文昌鱼4.1蛋白与血影蛋白和肌动蛋白结合起关键作用的位点，我们采用氨基酸切除法研究各表达蛋白和血影蛋白与肌动蛋白结合能力。文昌鱼中的保守结构域包括FERM结构域、FA结构域和CTD结构域。散布在这些保守结构域之间的区域，在FERM结构域N-端的头部区域为U1，在FA和CTD结构域之间的为U2/3。首先切除U1和FERM结构域，构建了FUC重组子，其重组蛋白具有结合能力，但与全长比，结合能力下降了1/3；在FUC基础上构建FA结构域重组子，其重组表达蛋白没有结合能力；在FUC基础上切除FA结构域，得到UC重组子，其重组蛋白结合能力与全长相比下降了1/2左右；将UC中的CTD结构域切除，获得U2/3重组子，该重组蛋白的结合能力与UC相近；将U2/3结构域的前16个氨基酸切除后，U17/68保持了与U2/3相同的结合能力。
U2/3结构域共含有68个氨基酸，在此基础上，我们将U2/3结构域分成四部分，进行多肽合成，然后进行ELISA分析。实验结果表明，U1/16和U34/50没有结合能力，U17/33有微弱的结合，U51/68有很强的结合，但是与U2/3相比，结合能力明显下降。进一步采用定点突变，发现U2/3中酸性氨基酸D387的突变，使其结合能力有所下降，但仍具有结合能力，该氨基酸位点D387位于U34/50多肽中，为寻找更为关键的位点，还需进一步将U51/68多肽中的一些氨基酸进行突变。
通过我们的实验发现，文昌鱼4.1蛋白的U2/3结构域仍然具有与血影蛋白和肌动蛋白结合的能力，并且该结构域处于FA和CTD结构域之间，脊椎动物SAB结构域也处于FA结构域和CTD结构域之间，加上文昌鱼特殊的进化地位，我们推测文昌鱼4.1蛋白U2/3结构域极有可能是脊椎动物4.1蛋白SAB结构域进化的原型。我们的实验结果还表明文昌鱼U2/3结构域C-端的18个氨基酸，对4.1蛋白与血影蛋白和肌动蛋白的结合是极为关键的。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国海洋大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q51【目录】：
缩略语5-6摘要6-8Abstract8-12第一章 文献综述12-33 1. 红细胞膜12-20
1.1 红细胞膜骨架12-13
1.2 红细胞膜蛋白13-20
1.2.1 血影蛋白14-16
1.2.2 肌动蛋白16-17
1.2.3 锚蛋白17-18
1.2.4 血红细胞 4.1 蛋白18-19
1.2.5 内收蛋白19-20 2. 4.1蛋白家族20-30
2.1 血红细胞 4.1 蛋白22-29
2.1.1 血红细胞 4.1 蛋白的存在形式22
2.1.2 血红细胞 4.1 蛋白各结构域在红细胞膜骨架中的功能22-24
2.1.3 血红细胞 4.1 蛋白的可变剪切与功能24-25
2.1.4 有核细胞中的 4.1R亚型及其亚细胞定位信号25-27
2.1.5 血红细胞 4.1R蛋白结合血影蛋白/肌动蛋白最小结构域27-29
2.2 4.1蛋白家族的其它成员29-30 3. 文昌鱼4.1蛋白30-31 4. 本文的研究目的和研究路线31-33
4.1 研究目的31-32
4.2 技术路线32-33第二章 文昌鱼 4.1 蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结合活性中心的鉴定33-83 1. 前言33 2. 材料和方法33-58
2.1 实验材料33-37
2.1.1 实验仪器33
2.1.2 质粒与菌株33-34
2.1.3 PCR扩增所需试剂34
2.1.4 构建表达载体与菌株相关试剂与溶液34
2.1.5 重组蛋白的诱导表达相关溶液34-35
2.1.6 SDS-PAGE相关缓冲液35-36
2.1.7 BCA法测定蛋白质浓度相关试剂36
2.1.8 包涵体复性相关溶液36-37
2.1.9 重组蛋白结合分析所需试剂和溶液37
2.2 实验方法37-58
2.2.1 文昌鱼BjP4.1 氨基酸序列的生物信息学分析37-39
2.2.2 文昌鱼rBjP4.1 和人类 4.1R（EPB41）蛋白与血影蛋白和肌动蛋白之间的结合活性分析39-41
2.2.3 结构域切除法寻找文昌鱼BjP4.1 蛋白结合活性中心41-55
2.2.4 多肽合成法寻找文昌鱼BjP4.1 蛋白的结合活性中心55
2.2.5 点突变法寻找文昌鱼BjP4.1 蛋白的结合活性位点55-58 3. 结果58-81
3.1 文昌鱼BjP4.1 蛋白结构域分析58
3.2 文昌鱼 4.1 蛋白的系统进化分析58-60
3.3 4.1蛋白家族的基因结构分析60-62
3.4 文昌鱼BjP4.1 蛋白氨基酸序列特征62-67
3.4.1 文昌鱼BjP4.1 蛋白氨基酸序列核定位信号的预测62-64
3.4.2 文昌鱼BjP4.1 氨基酸序列中的富亮氨酸序列64
3.4.3 文昌鱼BjP4.1 氨基酸序列全长的多序列比对64-67
3.5 文昌鱼BjP4.1 蛋白U2/3 结构域二级结构比较分析67
3.6 文昌鱼BjP4.1 蛋白与人类 4.1R结合能力分析67-69
3.7 文昌鱼BjP4.1 切除结构域重组子的蛋白表达和纯化69-74
3.7.1 FUC、FA、UC、U2/3 和U17/68 结构域片段的获得70-71
3.7.2 pET-28-FUC、pET-28-FA 、pET-28-UC、pET-28-U2/3、pET-28-U17/68 表达载体的构建71-72
3.7.3 重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化72-74
3.8 重组子pET-28-FUC、pET-28-FA、pET-28-UC、pET-28-U2/3、pET-28-U17/68 表达蛋白的结合分析74-77
3.9 多肽的结合分析77-78
3.10 点突变对文昌鱼BjP4.1 蛋白结合能力的影响78-81 4. 讨论81-83结论83-85参考文献85-98致谢98-99作者简介99硕士研究生期间发表的学术论文99
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