临床免疫学检验（理论）核心考点整理
教材：人民卫生出版社《临床免疫学检验（第5版）》&&杂交瘤技术【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷 （HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。
（一）小鼠骨髓瘤细胞理想骨髓瘤细胞的条件：①细胞株稳定，易于传代培养；②细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；③该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；⑤融合率高。目前最常用的是NS-1和SP2/O细胞株（二）免疫脾细胞多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。
（三）细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作细胞融合剂，浓度30~50 %之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本 细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。
正常培养细胞
TK缺陷细胞
HGPRT缺陷细胞
杂交瘤细胞
正常培养基
&&免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。【原理】可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂的作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应也出现浊度。优点：稳定性好、敏感度精确度&高、简便快速、易于自动化【影响因素】1、抗原抗体的比例钩状效应（）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。2、抗体的质量：特异性强、效价高、亲和力强、型抗体3、抗原抗体反应的环境：反应液最适，离子强度大（常用磷酸盐缓冲液最为反应液）4、增浊剂：如聚乙二醇、吐温【分类】速率比浊法和终点比浊法；透射免疫浊法和散射免疫比浊法；免疫胶乳比浊法&凝集反应与沉淀反应有何异同一、相同点：①都是抗原抗体的特异性反应；②都分为两个阶段，抗原抗体特异性结合和出现可见复合物阶段；③有相同的反应机制和影响因素。二、不同点
颗粒性抗原
或可溶性抗原致敏的颗粒
可溶性抗原
第一阶段：数秒至数分钟
第二阶段：数分钟至数小时
第一阶段：几秒至几十秒
第二阶段：几十分钟至数小时
出现凝集块
出现沉淀物
&免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。【原理】可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂的作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应也出现浊度。优点：稳定性好、敏感度/精确度 高、简便快速、易于自动化【影响因素】1、抗原抗体的比例钩状效应（high dose hook effect）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。2、抗体的质量：特异性强、效价高、亲和力强、R型抗体3、抗原抗体反应的环境：反应液最适pH 6.5~8.5，离子强度大（常用磷酸盐缓冲液PBS最为反应液）4、增浊剂：如聚乙二醇PEG、吐温-20【分类】速率比浊法和终点比浊法；透射免疫浊法和散射免疫比浊法；免疫胶乳比浊法&时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。它具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等优点，已在临床检测中广泛使用。【基本原理】1、时间分辨：通常各种组织、蛋白或其他化合物，在激发光照射下都能发出一定波长的自发荧光，这些荧光是非特异性的，会干扰荧光免疫测定，影响其特异性和灵敏度，但它们的荧光寿命常较短（1~10 ns），最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10~1000 μs），因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。
这是本技术具有高灵敏度的原因之一。2、stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（通常为273nm），激发/发射光谱不重叠，用简单的滤光片就能把激发光和发射光分开，可消除激发光散射引起的干扰。3、发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm&10nm，利用615nm&5nm的滤光片只允许此波段的发射光通过，可排除其余波长的荧光。生物样品的本底荧光波长通常在350~600 nm，故在615nm&5nm波段内，来自生物样品的荧光干扰极少，可有效降低本底荧光。镧系元素的激发光谱则较宽，通常为300~350 nm，非常有利于增加激发能，提高检测的灵敏度。4、荧光标记物的相对比活性：测定Eu3+螯合物发射荧光采用的激发光源为脉冲氙灯，其工作频率为1000次/秒，由光导纤维闪光管的控制系统。比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。在测量时间内，Eu3+可被反复激发，每次激发后，他可很快由激发态回到基态，发射荧光；然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，这就大大提高了荧光标记物的比活性。5、信号增强：免疫反应完成后，形成Eu3+标记的抗原抗体复合物，其在弱碱性溶液中的激发荧光信号较弱，加入酸性增强液可使Eu3+标记的抗原抗体复合物的pH降至2~3，Eu3+从复合物上完全解离，游离的Eu3+可被增强液中的螯合剂所螯合，在协同剂等成分的作用下，与增强液中的β-二酮体生成以Eu3+为核心的保护性胶态分子团，它是具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。（二）标记物和标记方法1、标记物：用于本技术测定的标记物是镧系元素，其中铕（Eu3+）和铽（Tb3+）的荧光寿命特别长且荧光强度高，多用这两元素作为标记物，其中Eu3+最为常用。镧系元素在游离状态下的荧光相对较弱，与螯合剂如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）等形成螯合物后，可使荧光强度增强。螯合物的荧光寿命与配体有关。2、标记方法：需利用具有双功能基团的螯合剂，一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。常用的双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等，此法可允许每个蛋白质分子上标记多个Eu3+而不影响其生物学活性和稳定性。
螯合剂可先螯合Eu3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合Eu3+（两步法）。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子蛋白载体（牛血清白蛋白，多聚赖氨酸等）连接，再标记Eu3+。
（三）方法类型1、双抗体夹心法：将待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体 - 待测抗原 - Eu3+标记抗体 复合物，在酸性增强液的作用下，复合物中的Eu3+从免疫复合物上解离并形成螯合物，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原的含量。2、固相抗体竞争法：将待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所得荧光强度与待检抗原含量负相关。3、固相抗原竞争法：与固相抗体竞争法类似，只是第一步改成将待检抗原和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体。（四）方法评价1、优点：灵敏度高，检出下限为10^-18mol/L（普通荧光免疫计数仅为10^-8mol/L）。分析范围宽，可达4~5个数量级。标记结合物稳定，有效使用期长。测量快速，易于自动化。本法在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面均可与RIA相媲美，是超微量物质分析方法中最有发展前途的一项技术。2、缺点：易受环境、试剂和容器中镧系元素离子的污染，使检测本底增高。&酶联免疫吸附试验（ELISA）【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
（一）ELISA检测抗原的方法主要有：1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD）的Ag。
先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合，形成 固相抗体-待测抗原-酶标记抗体 复合物，为&双抗体夹心&；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目的检测。
2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇，
分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别与不同的抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）
3、竞争法：适用于小分子Ag或半抗原（只有一个AD）。
先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原，待测样本中的抗原与酶标记抗原 竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。（二）ELISA检测抗体的方法主要有：1、间接法：检测Ab最常用的方法。常用酶标记羊抗人IgG。2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb的测定常用此法。3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质，不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb和HBeAb。原理见下：（1）HBcAb的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，，然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，此时待测标本中的HBcAb与酶标记HBcAb竞争性地与固相载体上的核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBcAb的含量负相关。（2）HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的HBeAb和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg，温育后洗涤，加入酶标记的HBeAb，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中HBeAb的含量呈负相关。4、捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig类别的测定，最常用于病原体急性感染诊断中IgM型抗体检测。原理：首先将针对IgM的第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有的IgM（特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其与固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原的酶标记抗体，形成 固相抗人μ链IgM-抗原-酶标记抗体 复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM进行定性或定量测定。此法临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM抗体，急性乙型肝炎时可检测抗HBc-IgM抗体。&电化学发光免疫分析（ECLIA）【原理】是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应（它包括电化学和化学发光两个过程）。在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体 复合物，复合物进入流动室，同时注入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在点击下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本缓冲液被冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光信号由安装在流动室上方的光信号检测器检测，光的强度与待测抗原的浓度成正比。&
【特点】：①三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始的发光，持续时间长，信号强度高，容易测定、控制；②三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性；③试剂灵敏度高，稳定性好。&&生物素-亲合素系统【特点】：高特异性、高敏感性、稳定强、实用性强&【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节，也可用于固相包被（或分离）环节&&一、应用于固相载体的包被环节链霉亲合素（亲合素）为弱酸性蛋白，可以吸附在固相载体（聚苯乙烯微孔板或纳米微球）表面，形成链霉亲合素包被固相载体；利用生物素标记抗原（或抗体），使待包被的抗原（抗体）通过生物素与固相材料表面的链霉亲合素结合，实现间接包被。此种包被模式不但可增加抗原（或抗体）包被数量，也可减少空间位阻效应，提高抗原（或抗体）的利用效率。此外，若固相材料不与生物素化抗原（或抗体）结合，待生物素化抗原（或抗体）与待检抗体（或抗原）反应后，再加入链霉亲合素预包被磁性纳米微球，含有生物素的免疫复合物可结合在固相载体表面，达到同样的分离效果。二、应用于检测系统的信号放大生物素-亲合素系统用于检测信号放大，可提高标记免疫分析的敏感性。基本方式有 生物素-亲合素-生物素 模式（BAB）和 生物素-亲合素 模式（BA）或标记亲合素模式。如将生物素标记在第一抗体上称为直接法，如生物素标记在第二抗体上称为间接法。①生物素-亲合素-生物素模式的特点是生物素标记分子（如生物素标记抗体/酶蛋白），以游离亲合素为桥，连接 抗原-抗体 和信号检测系统；由于一个亲合素分子能同时结合4个生物素，且一个生物素大分子可标记多个生物素而产生级联放大效应，提升检测敏感性。实际应用中的ABC法：预先按一定比例将亲合素与生物素标记示踪物质（如生物素标记ALP）混合，形成可溶性的 亲合素-生物素化酶标 复合物，同时确保预留一定位点与生物素化的抗体（或抗原）结合。此种方法能减少操作步骤，又能实现标准化操作（有商品化的试剂）。将ABC法应用于双抗体夹心ELISA中，形成ABC-ELISA，为常用方法。
固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等）标记抗体或抗原作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。
（一）斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）
【原理】是在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的（一般5min左右完成）阳性反应在膜上呈现红色斑点。
本法简化了操作步骤，达到简便的目的，已成为&床旁检测（POCT）&的主要方法之一。【方法类型】：&&①双抗体夹心法：将抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检标本，若标本中有待测抗原则在渗滤过程中与膜上抗体结合，然后滴加胶体金标记抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。②间接法：将抗原包被在硝酸纤维素膜上，依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗人IgG抗体，再加洗涤液洗涤，&阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。本法因受非目的IgG的干扰，易产生假阳性，临床上较少使用。（二）斑点金免疫层析试验（DICA）【原理】是将胶体金标记和蛋白质层析 技术相结合的，以硝酸纤维素膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。在DICA中，滴加在膜一端的标本溶液受载体末的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。【方法类型】：双抗体夹心法、竞争法、间接法
（三）临床应用及评价
1、特点：操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便于保存等特点。
2、灵敏度问题：灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，临床应用中应引起高度重视。
3、临床应用：临床只能作为定性/半定量 试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如人绒毛膜促性腺激素HCG）。&斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）【原理】与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为对蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。【技术要点】1、抗原包被膜：加少量（1~2μL）抗原于膜上。由于NC膜吸附力强，故需在包被后进行封闭。2、抗原抗体反应：滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗。3、显色反应：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP标记物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。【方法评价】斑点-ELISA的优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高6~8倍；试剂用量较ELISA约节约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存（-20℃可长达半年），不影响其活性。&免疫印迹试验（IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法（EITB），通常又称Western-blot。【原理】是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析相结合的技术，具有分析容量大、敏感性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种常用方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。【技术要点】1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极涌动，分子量越小，涌动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有染色后才显出电泳区带）。2、电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1~2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离效果肉眼仍不可见。3、酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3,3-二氨基联苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。【方法学评价】1、抗体的性质：影响本试验成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体时别的表位的性质。只有那些能识别耐变形表位的抗体可与抗原结合，所以在该试验中常选用多克隆抗体。2、IBT的灵敏度：一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩。其他方法都是针对增强信号本身设计的，包括使用信号更好和更强的荧光实际或使条带局部酶的活性增强等。3、IBT法在临床应用中存在一定局限性。
PS：本试验是HIV/AIDS的确诊试验。&
非标记抗体酶免疫组织化学染色&首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性
【技术类型】
（一）过氧化物酶抗过氧化物酶酶（PAP）法是在酶桥法的基础上加以改良。本法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。该复合物由两个抗酶抗体和三个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。
通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同与酶桥法相比，PAP法操作简便，分三步；PAP复合物结构稳定，避免了酶桥法中标记易脱落的弊端；敏感性高；背景着色淡，，因为即使桥联抗体存在有非特异性抗体的可能，但因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合。并且，如果抗酶抗体中存在着非抗酶抗体，当其与桥抗体或组织成分结合时，由于其不能与酶结合，也不会产生非特异性反应。
（二）双桥PAP法该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未饱和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体未饱和的Fc段结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测又实用价值。
（三）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP）法因部分组织细胞内含内源性过氧化物酶，限制了HRP的广泛应用，需选用其他酶免疫组织化学反应。本法是用碱性磷酸酶（ALP）代替HRP建立的碱性磷酸酶（ALP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。&
流式细胞术（FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。&&【工作原理】采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行分析处理，保证了检测速度与统计分析精确性。因而能同时从一个细胞上获取多种参数资料，保证对该细胞进行详细的分析。一、细胞分析原理1、样品进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。2、鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。3、信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞大小和核酸含量等指标。二、细胞分选原理当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。
见上图，前向散射光（线性、对数）FS：反映颗粒的大小，侧向散射光（线性、对数）SS：反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光（线性、对数、峰值）FL：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。
见上图，横轴反映FS的强弱，纵轴反映SS的强弱。根据细胞大小和结构的不同，外周血白细胞在本图上可被明显地区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。&Ficoll分离液法主要用于分离PBMCs，是一种单次差速密度梯度离心法。聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，商品名Ficoll。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液做适当稀释后，轻轻叠加在分层液的上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带：
由于红细胞和粒细胞比重大于分层液，同时因红细胞在Ficoll液中凝聚成串而沉于管底，血小板则因密度小而悬浮于血浆中，只有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面之中，呈白膜状为白膜层。吸取该层细胞，经洗涤离心重悬即为单个核细胞。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90~95 %，细胞收率可达80%以上，但室温超过25℃时可影响细胞收率。&乙型肝炎病毒的检验1、HBsAg（乙肝病毒表面抗原）：可采用固相RIA、ELISA、反向间接血凝实验等方法检测，是乙型肝炎早期诊断的重要指标。目前可采用CLIA对血清中的HBsAg进行定量检测，对肝炎患者动态评价病情与药物疗效很有价值。乙型肝炎表面抗原，存在于HBV的外壳部分。血清中检出HBsAg是乙肝的早期诊断指标之一，是乙肝患者血清中首先出现的病毒标志物，急性肝炎潜伏期即可出现养性，先于患者临床症状级肝功能异常（如血清转氨酶ALT升高）1~7周，到恢复期HBsAg滴度逐渐降低乃至消失。仅为HBV感染的标志，不反映病毒有无复制、复制程度及预后。&2、HBsAb（乙肝病毒表面抗体）：是一种保护性抗体，也是机体感染或接种乙肝疫苗的标志。目前常用固相RIA与ELISA法检测之。接受HBV疫苗接种后，血清中可出现HBsAb阳性。作为疫苗免疫机体产生的抗体，对HBV的感染具有保护性免疫作用。乙肝疫苗接种者一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往感染。 HBsAb阳性可提示急性感染后的恢复期。3、HBeAg（乙肝病毒e抗原）：为病毒复制标志，多存在于HBsAg阳性的标本中，急性乙肝患者血清HBeAg持续阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。在血清中的出现时间稍后于HBsAg，是HBV复制活跃的血清学指标，其水平与病毒复制、肝脏损害程度成正比，因此HBeAg是乙肝患者有较强传染性的标志。4、HBeAb（乙肝病毒e抗体）：多出现于急性肝炎恢复期的患者中，比HBsAb转阳要早，常在HBsAg即将消失或已经消失时检出，可长期存在。当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，说明病毒复制减少，传染性弱（但不是保护性抗体）。 HBeAg的血清学转换是指HBeAg含量消失同时伴HBeAb出现，是目前临床上慢性乙肝治疗的近期目标（最初目标是减少乙肝病毒的DNA复制）。5、HBcAb（乙肝病毒核心抗体）是乙肝急性感染的早期标志，在血清中存在的时间长，包括IgM和IgG。抗HBc&IgM是机体感染后最早在血液中出现的特异抗体，是新近感染或病毒复制的标志。抗HBc-IgG在感染后逐步产生。
高滴度的HBcAb存在常表示体内有HBV复制。HBcAb阳性时表示乙肝现症感染或既往感染。抗HBc不是保护性抗体，高滴度抗HBc-IgM是急性或近期感染的重要指标，在慢性肝炎活动期也可呈阳性，标志着乙肝病毒在复制，有传染性。抗HBc-IgG可持续存在数年至数十年，是既往感染的标志。
大三阳：以上指标中的1、3、5为阳性；小三阳：以上指标中的1、4、5为阳性。6、HBcAb-IgM：是早期HBV感染的特异性血清标志。初次感染早期即上升，数月后无论HBsAg消失与否，HBcAb-IgM表达稳定，对于急性肝炎诊断很有价值。其效价降低常提示预后较好。长期不降至正常范围者，提示有转化为慢性肝炎的可能。7、pre-S1：即乙肝病毒前S1抗原，作为病毒外膜蛋白成分存在于HBV Dane颗粒和管形颗粒上，在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面有着十分重要的意义。前S1抗原与HBV-DNA、HBeAg检测率高度符合，是一项十分重要的病毒复制指标。前S1抗原可以随HBeAg消失而消失，与阴转时间正相关，可作为病毒清除与病毒转阴的指标。HBeAb阳性的慢性乙肝患者和HBV慢性无症状的携带者中，前S1抗原阳性可表示病毒的复制。该指标阳性的患者传播病毒的危险性明显高于阴性/无症状的携带者。前S1抗原阳性常提示急性乙肝向慢性乙肝的转变。该指标阴转越早、疗程越短，预后也越好。8、pre-S2：即乙肝病毒前S2抗原，其上具有高免疫性的抗原决定簇和多聚蛋白受体，为人类T/B淋巴细胞的识别表位，pre-S2与HBV的感染和复制有密切的关系，对临床早期诊断，了解预后及制备乙肝高效疫苗有重要意义。前S2抗原与HBsAg阳性存在显著相关性。在急性乙肝中，前S2抗原与HBsAg都可作为HBV复制标志。在慢性乙肝中，前S2抗原的出现提示慢性肝炎进入活动期。该抗原长期存在，提示患者有转为慢性乙肝的可能。前S2抗原不仅能判断HBV的感染，而且对观测疾病预后、药物选择及疗效观察也有作用，是对乙肝两对半的有效补充。以上指标中的1、2、3、4、5、7、8项，在临床上称为乙肝七项~
潜伏期或急性乙肝早期
急性或慢性感染，以HbcAb-IgM鉴别；
病毒复制活跃，传染性强（大三阳）
急性HBV感染趋于恢复；
慢性乙肝携带者（小三阳）
急性HBV感染恢复期，有免疫力
乙肝恢复期，已有免疫力
过去感染，但无法检出HbsAg；
低水平慢性感染；无症状携带者
成功接种过乙肝疫苗，
或以前感染过HBV，现已康复，有免疫力
&超敏反应：是指机体接触到某种抗原并且致敏后，再次受到相同抗原刺激时表现出的增高的敏感性/反应性，此类免疫应答导致的机体功能紊乱称~。
超敏反应类型
免疫复合物型
Th1，Th2，CTL
效应细胞和成分
嗜碱性粒细胞
FcR+细胞（吞噬细胞、NK细胞）
巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、CTL
初次介导组分
血管活性胺
抗原-抗体，补体复合物
IFN-γ、IL-4/5、eotaxin、细胞毒素
二次介导组分
白三烯、PGD2、PAF、细胞因子
溶酶体酶、穿孔素
趋化因子、细胞因子、细胞毒素、炎症介质
&PS：II/III 型超敏反应是AID的机制，IV 型超敏反应是排斥反应的机制。&变应原：是指引起速发型超敏反应的抗原，其经吸入或食入等途径进入人体后能引起IgE类抗体产生并导致变态反应。（引起I 型超敏反应的特异性IgE型抗体称为变应素）&常见I 型超敏反应性疾病：全身超敏反应（药物过敏性休克，青霉素引发的最常见；血清过敏性休克），局部性超敏反应（呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应）常见II 型超敏反应性疾病：输血反应，HDN，AIHA，药物过敏性血细胞减少，肺出血肾炎综合征。常见III 型超敏反应性疾病：局部免疫复合物病（Arhus反应、类Arthus反应），全身免疫复合物病（血清病、链球菌感染后的肾小球肾炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮SLE）常见IV 型超敏反应性疾病：感染性迟发型超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应。&新生儿溶血病（HDN）母子间血型不合是引起HDN的主要原因。如母亲为Rh阴性血型，胎儿为Rh阳性血型，在首次分娩时，胎儿血进入母体内，母亲被胎儿的Rh阳性红细胞致敏，产生以IgG类为主的抗Rh抗体。当体内产生Rh抗体的母亲再次妊娠时，母体内的Rh抗体便可通过胎盘进入胎儿体内，与其红细胞膜上的RhD抗原结合，使红细胞被溶解破坏（血管外溶血），引起流产或发生新生儿溶血。初次分娩后，72h内给母体内注射Rh抗体，能及时清除母体内的Rh阳性红细胞，可有效预防再次妊娠时发生HDN。【抗血细胞抗体的检测】抗血细胞抗体大多属于不完全抗体，这种抗体与相应抗原结合后不发生凝集现象。Rh抗体的检测：为防止Rh血型不合所致死胎或HDN的发生，可对孕妇血清或胎儿羊水的Rh抗体进行检测，最为常用的是酶介质法。酶介质法原理：Rh(D)抗体多为IgG型不完全抗体，当它与有相应抗原的红细胞相遇时，便与红细胞上的特异性抗原结合。但由于IgG型不完全抗原的两个抗原决定簇的跨度小于红细胞因排斥力而产生的最小间距（250nm），所以不能将相邻的红细胞彼此连接形成肉眼可见的凝集。加入酶介质可破坏红细胞膜表面的唾液酸糖肽，降低红细胞表面负电荷，减小红细胞间斥力，使红细胞间的距离缩短，有利于IgG型不完全抗体在两个红细胞抗原位点间连接，产生肉眼可见的凝集。最常用的酶是1% 木瓜/菠萝 蛋白酶。【临床意义】Rh血型抗原主要有5种，其中D抗原的抗原性最强，出现频率高。凡带有D抗原者称Rh阳性，不带D抗原者为Rh阴性。当Rh阴性的个体受到D抗原的刺激（输血、妊娠、器官移植）后，可产生D抗体，若该个体再次受到D抗原阳性血液就可发生溶血反应。在Rh血型不合所致的HDN中，母亲为Rh阴性血型，但体内产生了抗Rh抗体。为及早发现胎儿有胎内溶血，应尽早对孕妇Rh抗体进行监测。一般妊娠16周应作首次Rh抗体检测，如结果为阴性则每6~8周复查一次。如结果为阳性，则第20周重复检测，以后每隔2~4周复查一次，直至分娩。Rh抗体滴度&1:16或1:32时，胎儿很可能发生水肿。Rh抗体超过1:64即应立即采取措施，如孕妇血浆交换术等。&青霉素引起的超敏反应：青霉素可导致全部四型超敏反应。一、I型：全身超敏反应，青霉素可引发过敏性休克（是全身超敏反应中最常见的）。【机制】青霉素是一种半抗原，其降解产物青梅噻唑醛酸或青霉烯酸，与体内组织蛋白共价结合，形成青霉噻唑蛋白或青霉烯酸蛋白后，获得免疫原性，可刺激机体产生特异性IgE抗体，致敏肥大细胞和嗜酸性粒细胞。当机体再次接触青霉素时，青霉噻唑蛋白或青霉烯酸蛋白可通过交联结合靶细胞表面的特异性IgE分子，严重时可发生过敏性休克甚至死亡。二、II型：药物过敏性血细胞减少症【机制】青霉素是一种半抗原，其抗原表位能与血细胞膜蛋白或血浆蛋白结合获得免疫原性，从而刺激机体产生抗药物抗原表位的特异性抗体。这种抗体与结合有药物的红细胞、粒细胞、血小板作用，或与药物结合，形成抗原-抗体复合物后再与具有Fc受体的血细胞结合，可引起药物性溶贫、粒细胞减少症和血小板减少性紫癜等。三、III型：类血清病样反应【机制】有时使用大剂量青霉素后可出现，主要临床症状是发热、皮疹（风疹为主）、淋巴结肿大、关节肿痛和一过性蛋白尿等。这是由于患者体内产生抗青霉素（及其降解产物）抗体（机制同上），与体内青霉素（及其降解产物）结合，形成循环免疫复合物所致。四、IV型：接触性皮炎【机制】接触性皮炎是典型的接触性迟发超敏反应。接触小分子半抗原物质，如某些药物（青霉素）可引起。青霉素及其降解产物与体内蛋白质结合，变为完全抗原，致敏T淋巴细胞。当机体再次接触青霉素时，可发生接触性皮炎，出现IV型超敏反应。皮损表现为：红肿、皮疹、水疱，重者可出现剥脱性皮炎。&原发性免疫缺陷病（PIDD）：是指由遗传因素或先天免疫系统发育不良而造成免疫功能障碍所致的疾病。包括：一、原发性B细胞缺陷病包括：B细胞先天发育不全、或不能接受T细胞传递的信号，Ig水平低或缺陷。【检验】主要包括B细胞（及其亚类）数量和...
人人移动客户端下载}