君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
苏云金芽胞杆菌sigK基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口《梦幻之星OL2》台服封测 中文汉化满足剧情党
游戏橘子旗下代理的《》台服于昨日启动封测，本次测试将持续到3月9日。从公布的截图的汉化程度来看，还是算比较不错的。点击小图可看大图本次测试仅开放猎人（Hunter）、游侠（Ranger）、术士（Force）三大职业供玩家体验，共开放五张地图副本，玩家可前往纳贝流士行星的森林与雪原、安杜斯奇亚行星的火山洞窟以及莉莉芭行星的沙漠与地下坑道等风貌全然不同的地图副本。点击小图可看大图由于保留了日文配音，所以玩家能在游戏的初期就遇见由下野纮、木村良平、日笠阳子等日本知名声优发声配音的NPC。创建角色界面已全部汉化《梦幻之星》系列在日本有25年历史，是SEGA旗下代表作之一，《》在日本已经有超过300万个注册用户、同时上线人数保持10万人，台服玩家将能享受到日服没有的独占中国风专属武器、时装、大厅场景等内容，确定采用日语配音加中文字幕，让玩家感受原汁原味的PSO2。游戏也会像日服一样与各大人气动画进行联动，推出《魔法少女小圆》、初音MIKU等联动服装及武器。
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGBS13S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGBS13S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGCOF3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGCOF3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGDJF3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGDJF3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGE4S3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGE4S3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGF2J3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGF2J3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFIGFMD3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGFMD3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGGH43S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGGH43S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFIGH4O3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGH4O3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGHUN3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGHUN3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGIO93S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGIO93S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFIGJ7A3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGJ7A3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGK5U3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGK5U3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGLL43S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGLL43S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFIGKS63S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFIGKS63S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICRT73S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFICRT73S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICSCJ3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFICSCJ3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICT9R3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICT9R3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFIGMAL3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFIGMAL3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFICNPN3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICNPN3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICORJ3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICORJ3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICPIL3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICPIL3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICQDV3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICQDV3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFICQU43S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFICQU43S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICTTO3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFICTTO3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICUJ73S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFICUJ73S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFICVJ53S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFICVJ53S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFID05T3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID05T3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFID.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFID.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFID1L23S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID1L23S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFID2GH3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID2GH3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFID30D3S010031.jpg
http://img4./photo/-19/t_9GFID30D3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFID3LV3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID3LV3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img4./photo/-19/600x450_9GFID4MD3S010031.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID4MD3S010031.jpg
《梦幻之星OL2》台服加入中国风内容一览
http://img3./photo/-19/600x450_9GFID.jpg
http://img3./photo/-19/t_9GFID.jpg
图集已浏览完毕重新浏览
梦幻之星OL2台服官网：http://tw./PSO2/pr/index.html
扫描关注网易发卡中心领取新游戏激活码新手卡
本文来源：网易游戏频道
关键词阅读：
不做嘴炮 只管约到
Recommend list当前位置： >>
97CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定
第二军医大学 硕士学位论文 抗CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定 姓名：吴兰 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：赵健
抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定摘要杂交瘤技术生产的鼠源单抗用于人类疾病的治疗时存在着严重缺陷，最主要的 问题是引起人抗鼠抗体（ＨＡＭＡ）免疫应答。为了克服鼠源性单克隆抗体应用于人体时所出现的ＨＡＭＡ反应等问题，人源化抗体应运而生。最早的人源化抗体是将鼠源单抗的可变区和人源抗体的恒定区组成的嵌合抗体，其抗原亲和力保持得很好，同时 免疫原性也得到了一定程度的下降。但由于嵌合抗体由于保留了全部的鼠可变区，临 床应用时仍可能发生强烈的ＨＡＭＡ反应。为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，人们考虑将鼠互补决定域（ＣＤＲ）区直接移植到人源抗体可变区中的框架区上，得到ＣＤＲ 移植抗体，也称为人源化抗体。在过去的十年中，人源化抗体的疗效已得到充分的肯 定。 ＣＤ２０抗原是一种Ｂ细胞分化抗原，仅位于前Ｂ细胞和成熟Ｂ细胞，它在９５％以上的Ｂ细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，Ｃ２８８）为美国Ｇｅｎｅｔｅｃｈ公司研制的以人ＣＤ２０分子为靶点的鼠／人嵌合抗体。Ｒｉｔｕｘａｎ已于１９９７年１１月获ＦＤＡ的批准上市，用于Ｂ细胞非霍 奇金淋巴瘤的临床治疗。但Ｃ２８８为嵌合抗体，临床上仍有人抗鼠免疫反应产生的报 道。为了尽可能降低免疫原性，提高临床使用的安全性，在本研究中，我们拟构建新 的抗ＣＤ２０人源化抗体并对其生物学功能进行鉴定。我们首先采用传统的杂交瘤技术制备了一株抗人ＣＤ２０单克隆抗体３Ｄ９，流式细胞术的结果表明，与ＣＤ２０单抗Ｃ２８８对照一样，该抗体都能与表达ＣＤ２０抗原 的Ｒａｊｉ细胞特异性结合。我们采用５’ＲＡＣＥ技术获得了３Ｄ９的可变区全长ｅＤＮＡ， 将可变区基因序列输入计算机在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中检索，证明是新克隆的抗体基因。获得３Ｄ９这株单抗的可变区基因之后，我们将它们分别与人源抗体的恒定区 连接，然后将嵌合抗体轻、重链基因分别克隆到真核表达载体，最后将嵌合抗体 轻、重链表达载体共转染ＣＨＯ．ＫＩ细胞，经选择培养基筛选后获得稳定表达抗体 蛋白的ＣＨＯ细胞克隆。获得的ＣＨＯ细胞培养上清经Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ亲和分离纯化获得 嵌合抗体Ｃ３Ｄ９；抗原结合活性结果表明该嵌合抗体能很好地与Ｒａｊｉ细胞结合。为了进一步减小嵌合抗体的免疫原性，我们利用计算机辅助设计对ＣＤ２０单抗 ３Ｄ９进行人源化改造。在确定了３Ｄ９可变区中ＣＤＲ区和Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ）区的 范围之后，我们将ＣＤＲ区直接移植到人源抗体模板的ＦＲ中，构建ＣＤＲ移植抗体， 并将获得的人源化轻、重链抗体基因克隆到表达载体共转染ＣＯＳ细胞，用流式细胞术测定其抗原结合活性，结果发现这个人源化抗体的亲和力基本完全丧失。为了重建 人源化抗体的亲和力，我们利用计算机辅助设计对可能影响抗体亲和力的ＦＲ区重要残基进行回复突变分析，分别构建了５条不同的人源化重链和５条不同的人源化轻链，经过活性筛选，我们发现对于人源化重链来说，框架区残基２７，３０，４３，４８，６７，６９，７ｌ，７３的回复突变是必要的，将它们全部突变为鼠源残基后得到了一个活性几乎等于嵌合抗体重链的人源化重链３Ｄ９ＶＨｂ。我们采用同样的方法对人源化轻链基因 进行改造，发现将轻链框架区残基３，４，４９全部回复突变获得的人源化轻链３Ｄ９ＶＬｂ 与３Ｄ９ＶＨｂ组成的人源化抗体Ｈ３Ｄ９的抗原结合活性几乎等同于嵌合抗体Ｃ３Ｄ９，在筛选得到高亲和力的人源化抗体Ｈ３Ｄ９之后，我们建立了高效表达Ｈ３Ｄ９的ＣＨＯ．Ｋ１细胞株。竞争抑制实验结果表明此人源化抗体它能与鼠源亲本抗体竞争结合Ｒａｊｉ细 胞，证实它保留了与鼠源抗体相似的亲和力和特异性，表明Ｈ３Ｄ９是一个改造成功的 人源化抗体。我们进一步对Ｈ３Ｄ９的体外生物学活性进行了分析，实验结果表明Ｈ３Ｄ９ 可有效介导对ＣＤ２０阳性的人淋巴瘤细胞Ｄａｕｌｉ和Ｒａｊｉ的补体介导的细胞溶解作用（ＣＤＣ）和抗体依赖细胞介导的细胞杀伤实验（ＡＤＣＣ）作用，并可诱导肿瘤细胞发生凋亡，生存率试验表明抗体组能显著延长小鼠的生存时间。提示它可望发展成为 新的非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）的靶向治疗抗体药物。关键词：非霍奇金淋巴瘤，单克隆抗体，ＣＤ２０，人源化．抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌｕｓｅｏｆ ｍｕｒｉｎｅ―ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂ）ｈａｓａｎｂｅｅｎ ｓｅｖｅｒｅｌｙｌｉｍｉｔｅｄ ｂｅｃａｕｓｅ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｅｌｉｃｉｔｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｏａｓｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｈｕｒｍｎ ａｎｔｉｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＨＡＭＡ）．Ａｎｅａｒｌｙ ａｔｔｅｍｐｔ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅｏｆｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｕｓｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｄａｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈａｔｈｅｉｒ ｍｏｕｓｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｓｔｉｌｌ ｅｖｏｋｅｓｔｒｏｎｇＨＡＭＡｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｉｎｃｅ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｈｕｒｍｎｓ．Ｔｏｆｕｒｔｈｅｒｒｅｄｕｃｅｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｇｒａＲｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｎｐｌｅｍｅ ｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄａｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｖｅｈａｖｅｂｅｅｎ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｔｅｎ ｙｅａｒｓ．ＣＤ２０ ｉｓａｎｏｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｅｔｒａｓｐａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｒｎｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｏｎｐｒｅ―Ｂａｎｄｍａｔｕｒｅ Ｂｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．ＴｈｅａｎｄＣＤ２０ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｎｏｒｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９５％ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａｓｉｓ ｎｅｉｔｈｅｒ ｓｈｅｄｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄａｆｔｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｙｂｉｎｄｉｎｇ，ｍａｋｉｎｇｉｔａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅｒｎｏｖａｌｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔＢ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｃ２８８）ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍＡｂ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｓａｌｏｗ―ｇｒａｄｅｏｒｆｏｌｌｉｃｕｌａｒＢ―ｃｅｌｌｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’Ｓｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂｃｈａｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎｍｕｒｉｎｅ―ｈｕｍａｎｃｈｉｍｅｒｉｃ ＭＡｂ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂ ｌｅ ｄｏｒｍｉｎｓｔｈｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧｌａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ丘ｏｍ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｈｅａｖｙＭＡｂ，ａｎｄｔｈｅｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ．Ｉｎｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｈａｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｉｚｅｄＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ．Ｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ｗｈｉｃｈ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍＡｂｓ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ ３ Ｄ９。Ｔｈｅ ｍＡｂｓ ３ Ｄ９ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ＣＤ２０ ｐｏｓｉｔｉｖｅＲａｊｉｃｅｌｌｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｕｓｅｍＡｂ Ｃ２８８．Ｔｈｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔａｎｄ ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｓ ｏｆ ３Ｄ９ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ．３一ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ５’ＲＡＣ Ｅ．Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ，ｔｈｅｈｅａｖｙｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｃＤＮＡｓ（ＶＨ）ｗｅｒｅｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ（ＣＨ）．Ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ，ｌｉｇｈｔ ａｎｄｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｉｎｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｌｙ ｉｎｓｅｒｔｅｄｒｅｓｕｌｔｉｎｇｔｈｅｃｈｉｍｅｒｉｃｌｉｇｈｔａｎｄｈｅａｖｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ．Ｔｈｅｎ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓＣＯ?－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＣＨＯ－－ＫＩｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＣ３ Ｄ９．Ａｎｔｉｇｅｎ―ｂｉｎｄｉｎｇｔｏａｃｔｉｖｉｔｙｔｏａｓｓａｙ ｃｅｉｌｓ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔ ａｌｌ ｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｍＡｂｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎｂｉｎｄ ｗｅｌｌＲａｊｉｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｄ．Ｉｎ ｔｈｅｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ，Ｃ３ Ｄ９ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｐａｒｅｎｔａｌ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｄｕｃｅＲａｊｉｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃｍｕｒｉｎｅａｆｆｍｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ，ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ３Ｄ９．Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ３Ｄ９ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｏｒｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｗｅｒｅ ｇｒａｆｔｅｄ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｏｒｈｅａｖｙｃｈａｉｎｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｗｅｒｅ ｏｆｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｉｎＣＯＳ ｃｅｌｌｓ．ＦＣ Ｍ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ，ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｒａｉｉ ｃｅｌｌｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔ，ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｌｍｏｓｔ ｌｏｓｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂａｓｉｎｇｏｎｔｈｅｔｈｅｏｒｙｔｈａｔ ｓｏｍｅｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅｈｕｍａｎＦＲｓａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｕｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｔｈａｔｍａｙｈａｖｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｎｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅｈｕｍａｎ ＦＲｓｗｅｒｅ，４．抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎｄ ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆＦＲ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ４８，６７，６９，７ １ ａｎｄ ７３ｏｎｒｅｓｉｄｕｅｓｏｎ２７，３０，４３， ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｔｈｅｈｅａｖｙｃｈａｉｎ ＦＲｓｏｒｒｅｓｉｄｕｅｓ ｃｈａｉｎ３，４，４９ＦＲｓ ｗｅｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｖｙｏｒｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ．Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎｏｆ ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈ３Ｄ９．Ｔｈｉｓｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ３Ｄ９．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｍｅｅｔｔｈｅ １１ｅｅｄ ｏｆ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｗｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＣＨＯ―ＫＩ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ｔｈａｔａｓｔａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ，Ｈ３ Ｄ９ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙｆｒｏｍｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｓｅｒｕｍ―ｆｒｅｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ，Ｈ３ Ｄ９ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｗｉｔｈ ３Ｄ９ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏＲａｊｉｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅａｖｉｄｉｔｙ（ｍｅａｎ ＩＣｓｏ＋ＳＤ）ｏｆＨ３Ｄ９ ｗａｓ ａｂｏｕｔａｎｄ ｅｑｕａｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ３ Ｄ９，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ａｆｆｆｍｉｔｙ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ａｌｌ Ｈ３Ｄ９ ｉｓａｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅ ｆｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ＣＤＣ，ＡＤＣＣ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍＡｂ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙ，ｄｕｅ ｔｏｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄ ｂｅｔｔｅｒ ｓａｆｅｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ，ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙａｎＨ３ Ｄ９ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｂｅａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｕｒｇｔｏ Ｎｏｎ Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｓｌｙｍｐｈｏｍａ（ＮＨＬ．）．ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｎｏｎ Ｈｏｄｇｋｉｎ’Ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＣＤ２０，ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．５．缩略词表英文缩写 英文全称Ｎｏｎ Ｈｏｄ感ｉｎ’Ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ中文全称 非霍奇金淋巴瘤 每分钟转速 牛血清白蛋白白细胞分化抗原 互补决定域Ｎ阻ＩｐｍＢＳＡＣＤＣｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆｄｉｆｒｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＣＤＲＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓＣＨ０ ｃｅｉｌｓ中国仓鼠卵巢细胞 二氨基联苯胺 二氢叶酸还原酶ＤＭＥＭ培养基 流式细胞仪ＤＡＢＤｉａｍｉｎｏｂｅｚｉｄｉｎＤＨＦＲＤｉｈｙｄｒｏ ｆｏ ｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅＤＭＥＭＦＡＣＳＤｕｌｂｅｃｃｏ’ＳｒｍｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ―ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｉｌ ｓｏｒｔｅｒＦＢＳＦｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ胎牛血清流式细胞术ＦＣＭＦＩＴＣＦｌｏｗ ｃｙｔｏ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ异硫氰酸荧光素 框架区 补体介导的细胞溶解作用ＦＲＦｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＣＤＣＨＡＭＡＨｕｒｍｎ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｃｅｌｌ人抗鼠抗体反应 抗体依赖细胞介导的细 胞杀伤实验Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡＤＣＣｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｉｔｙ．６一抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定英文缩写ＩＣｓｏ英文全称５０％Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ中文全称 半数抑制浓度 单克隆抗体千道尔顿ＭｃＡｂＫＤａＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＫｉｂｄａｌｔｏｎｓａｎｔｉｂｏｄｙ０ＤＯｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ光密度 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应ＰＢＳＰｈｏｓｐ ｈａｔｅ―ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＲｒ－ＰＣＲ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ逆转录聚合酶链反应ＡｍｐＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ氨苄青霉素 （千）碱基对（ｋ）ｂｐ（ｋｉｌｏ）Ｂａｓｅ ｐａｉｒ（ｓ）．７－独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第 二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位 论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博 硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后 适用本授权书） 学位论文作者签名：日期：导师签名： 日期： 年月年月日日．ｊ上―－‘一月ＩＪ吾非霍奇金氏淋巴瘤（ＮＨＬ）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为Ｂ细胞来源，约占８５％。在未治疗状态下，低度和部分中度恶性ＮＨＬ如小淋巴细胞性淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤的生长形式往往呈惰性过程，中位生存期 为５～９年。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时， 疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。而一些高度恶性的ＮＨＬ则死 亡率极高。 近年来，针对细胞表面分子的抗原靶向性治疗己取得了巨大进展并成为一种非常有发展前途的治疗方法，其中被广泛使用且富有成效的是抗ＣＤ２０的单抗制剂【ｌ】ｏＣＤ２０抗原是非结合性单抗疗法的一个理想靶点，因为该抗原具有克隆特异性，仅表达于所有的前Ｂ细胞和成熟Ｂ细胞，而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他造血细胞系；同时，ＣＤ２０分子在Ｂ淋巴瘤细胞表面的表达量异常增高，磷酸化增加，与Ｂ细胞淋巴瘤的发生密切相关。ＣＤ２０分子在超过９５％的Ｂ细胞性ＮＨＬ 中均有表达，且抗原分子在膜上比较暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化 和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变，因此成为治疗Ｂ细胞淋巴瘤的理想靶点。ＣＤ２０单抗疗法在治疗Ｂ细胞淋巴瘤中已取得了令人满意的效果，目前抗ＣＤ２０ 抗体主要有以下几种，按照其发挥抗肿瘤作用的不同功能分为两大类：（１）主要通过ＣＤＣ、ＡＤＣＣ（ＣＤＣＣ）作用发挥功能的：Ｃ２８８、ＩＦ５、２Ｈ７、２Ｆ２（２）主要 通过凋亡、ＡＤＣＣ（ＣＤＣＣ）作用发挥功能的：Ｂｌ、１１８８。美国ＩＤＥＣｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ公司针对Ｂ细胞淋巴瘤生产的人鼠嵌合抗ＣＤ２０单克隆抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｃ２８８是第 一个经美国ＦＤＡ批准用于治疗淋巴瘤的抗体。１９９７年批准上市。美罗华是一种嵌合型ＩｇＧｌ免疫球蛋白，它是通过转染相关基因结构到仓鼠卵细胞后表达的基因产物。美罗华含１３２８个氨基酸ｊ分子量约１４４ ＫＤ，由鼠抗ＣＤ２０单克隆抗体的可变 区Ｆａｂ和人ＩｇＧｌ抗体稳定区Ｆｃ片段构成。 杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＨＡＭＡ）［２－３】。由于传统的杂交瘤技术难以产抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定生高特异性、高亲和力的人源抗体，因此，我们拟通过基因工程技术构建人源化ＣＤ２０单克隆抗体，降低鼠源抗体的免疫原性。人源化抗体［４】是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起来的新型基 因工程抗体。第一代人源化抗体是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区融合而成 的嵌合抗体【５１，由于抗体的抗原亲和力是由其可变区决定的，因此嵌合抗体的亲和 力保持得很好【６】，同时免疫原性也得到了一定程度的降低。抗体的可变区是由超变区（ＣＤＲ）区和框架区（ＦＲ）区组成的，ＣＤＲ是高度可变的区域，直接介导抗体与抗原的结合。ＦＲ区相对保守，作为支架维持着ＣＤＲ区的空间位置，它是可变 区中产生免疫原性的主要区域。由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，临床应用时 仍常常会有强烈的ＨＡＭＡ反应【７１。因此，为了尽可能降低嵌合抗体的免疫原性， 人们考虑将鼠ＣＤＲ区直接移植到人源抗体可变区中的ＦＲ区上，仅仅保留抗原结 合部位ＣＤＲ，得到ＣＤＲ移植抗体，也就是人源化抗体，使它的免疫原性降到最小。但是，简单ＣＤＲ移植往往明显降低抗原一抗体反应的亲和力，甚至丧失与抗原结合 的能力。越来越多的研究结果表明，ＦＲ部分对于抗体ＣＤＲ的三维结构的维持和整个抗体的亲和常数仍起着很大作用，故人源化抗体的亲和力总比鼠源性抗体的亲和力弱【引，只有将ＦＲ中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性【８】。因此，如何确定ＦＲ中影响抗体活性的重要残基成为了抗体人源化的关键。 近年来人们利用抗体基因库，通过计算机技术对抗体分子的立体结构进行模拟分析，并鉴定出一些与抗原结合位点关系密切的鼠单抗ＦＲ上的氨基酸残基。在此基础上，发展了多种第二代ＣＤＲ移植人源化抗体的构建策略…】。目前应用较多 的是采取定位保留的方式，即人源化单抗以人ＦＲ保守序列为模板，但保留了鼠源 单抗可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括ＣＤＲ和ＦＲ中的一些关键残基【ｌ４。，使其在体内的半衰期和效应功能也更加接近于人抗体。具体地就是在通过计算机 辅助设计模拟出鼠源抗体抗原结合位点空间结构的基础上，进一步确定ＦＲｓ中与 ＣＤＲｓ紧密接触的残基（距离小于６Ａ），同时选取与鼠源抗体序列同源性最高的 人源抗体作为改形抗体的模板，参照构象模拟的结果并比较鼠源抗体和人源模板 以及各自家族的保守序列，对ＦＲｓ残基进行取舍，便可设计出入源化抗体的序列。 通过计算机辅助的分子模拟，人们已经成功构建出多株高亲和力的人源化抗体ｆ８】。第一部分抗人ＣＤ２０小鼠单克隆抗体的制备Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，商品名为美罗华．１９９７年由ＦＤＡ批准ｈ市。它是用Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴 瘤细胞系Ｒ扣免疫小鼠得到的。到目前为止，已经有ＣＤ２０单克隆抗体投入使用。 我们利用传统的杂交瘤技术，制各了一株高亲和力小鼠抗人ＣＤ２０单克隆抗体，并 对它们进行了鉴定。 近些年．临床上以Ｂ细胞表面标志分子为靶抗原，通过免疫细胞杀伤机制来 治疗Ｂ细胞淋巴瘤己取得了许多实质性进展。研究发现，同样是Ｂ细胞表面标志． ＣＤ２０分子比其它分子更具特片性，以ＣＤ２０分子作为靶抗原对Ｂ细胞淋巴瘤的抗 原靶向性治疗彳午临床上已取得了令人满意的疗效。 人ＣＤ２０分子又称为ＢＩ或Ｂｐ３５，有２９７个氨基酸残基，是Ｂ淋巴细胞表面 的ＩＩＪ型跨膜蛋白，与ＨＴｍ４和ＦｃＥＲＩｌ３㈣属于四次跨膜的蛋白质超家族。ＣＤ２０ 分予以非糖基化形式存在，其分子阜闭磷酸化程度小同而小同，范围为”～３６ ｋＤａ，仅限ｒ在』下常的Ｂ细胞和Ｂ淋巴瘤细胞表面表逃，在浆细胞中不表达，参 与Ｂ细胞的分化和发爵调控，是Ｂ细胞的重要分化抗原。１９８７年，Ｔｃｄｄｅｒ等首次 从人扁桃体Ｂ细胞的ｃＤＮＡ文库ｑｉ用杂交的方法将ＣＤ２０的基囡分离出来，井进 行了克隆，得到一段长２ ８ｋｂｐ的ｃＤＮＡ序列。 ＣＤ２０蛋白的结构虽移Ｊ是山其ｃＤＮＡ序列推测出束的，和细胞膜有三种可能的 拓扑结构。通过一系列的胰蛋白酶和蛋一酶Ｋ的酶解作用确定只有一种构浆存在， 即存在州个跨膜区（ＴＭＩ－－４），其巾只有ＴＭ３与ＴＭ４ ２问的氢基酸序列在细胞膜 外侧，ＴＭｌ和ＴＭ２相连，ＴＭ２与ＴＭ３之间的区域、Ｎ端和Ｃ端均在细胞质内图１ＣＤ２０分子的结构示意图抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定（图１）。所以ＣＤ２０分子在细胞外裸露较短，ＣＤ２０胞外区的抗原表位相对来说较 少。 ＣＤ２０在人体细胞中的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗Ｂ细 胞淋巴瘤的主要靶位点。尽管ＣＤ２０单抗Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ目前已被广泛应用于临床，且有较好的发展前景，但是它不能有效地杀伤低表达ＣＤ２０分子的Ｂ淋巴瘤细胞。因此， 要满足临床上提高疗效，增加单抗应用范围的不断要求，还需要探索一些新的治疗策略。针对这些问题，本课题旨在制备出具有更高功能活性的嵌合和人源化抗体并进一步探讨它可能的效应机理，为临床上研制、应用工程抗体及阐明其抑瘤机制提供物质基础。（一）实验材料１．菌株、细胞株菌株：大肠杆菌ＴＧｌ由本室传代保存。 细胞株：Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ购白ＡＴＣＣ，由本室保存； ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的骨髓瘤细胞ＮＳ―ｌ购自ＡＴＣＣ，由本室保存； ＣＨＯ细胞株由本室保存。２．引物及工具酶ＰＣＲ引物由Ｉｎｖｉ仃ｏｇｅｎ公司和上海生工生物工程技术服务有限公司合成； 限制性内切酶及Ｔ４Ｔａｑ ＤＮＡ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ均购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ购于美国Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ公司。３．Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒Ｒｅａｇｅｎｔ及５’ＲＡＣＥ试剂盒购于Ｉｎｖｉ订ｏｇｅｎ公司；Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ―ＰＣＲｋ证试剂盒购自ＱＩＡＧＥＮ公司；ｐＧＥＭ―Ｔ ｖｅｃｔｏｒ及ｐＧＥＭ―Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ均购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司： ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖｅｃｔｏｒ购自美国ｌｎｖｉ打ｏｇｅｎ公司；小量质粒抽提纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；小鼠抗体亚型检测试剂盒购自Ｓｉｇｍａ公司。４．ＤＮＡ分子量标准ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＨｉｎｄｌＩＩＭａｒｋｅｒ及ＥｃｏＲＩ Ｍａｒｋｅｒ为华美公司产品。５．细菌培养及其它生化试剂胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉为英国ＯＸＯＩＤ公司产品；琼脂糖及其他相关试剂购自实生公司； 聚丙烯酰胺凝胶及ＡＰＳ，ＴＥＭＥＤ购自华舜生物公司；ＰＶＤＦ膜为Ａｍｅｒｓｈａｍ公司产品； ＤＡＢ显色剂购自华舜生物公司；ＴｒｉｔｏｎＸ．１００购自华舜生物工程公司；配置纯化缓冲液时所用的生化试剂均购自生工公司。６．细胞培养及转染试剂新生小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品；ＲＰＭＩ．１６４０培养基和ＤＭＥＭ培养基均为ＧＩＢＣＯ公司产品； 透析胎牛血清购自ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ公司； 细胞冻存液：３０％胎牛血清＋１０％ＤＭＳＯ＋６０％无血清培养液，过滤除菌；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，无血清培养基ＯＰＴＩ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司； 次黄嘌呤，胸腺嘧啶脱氧核苷，甘氨酸，氨甲喋呤购自Ｓｉｇｍａ公司。７．抗体ＨＲＰ－羊抗鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及ＦＩＴＣ一羊抗鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）购自Ｚｙｍｅｄ公司；ＦＩＴＣ标记的和未标记的小鼠抗人ＣＤ２０单克隆抗体Ｃ２８８购自英国Ｓｅｒｏｔｅｃ公司。８．超滤装置及纯化柱１０ｋＤａ超滤膜包为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品；Ｐｒｏｔｅｉｎ―Ｇ亲和层析柱购自Ａｍｅｒｓｈａｍ公司。抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定９．主要仪器设备ＰＣＲ仪：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品；复日ＦＲ－９８０生物电泳图像分析系统：上海复日生物实验技术研制所产品； 细菌培养摇床：上海离心机械研究所产品；细胞培养瓶：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品； 细胞培养箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品； 生物安全柜：造鑫公司产品； 离心管和流式管：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品；ＸＤＳ．１Ｂ型显微镜：重庆光学仪器厂产品；．８０℃低温冰箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品； ＤＫ一６００型恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司产品； Ｃ２８８０Ｒ台式低温离心机：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品； 蛋白电泳，转移装置：ＢＩＯ．ＲＡＤ公司产品； 流式细胞仪（ＦＡＣＳｃａｎ）：ＢＤ公司产品； 流式细胞仪（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ）：ＢＤ公司产品； 超声仪为上海ＢＲＡＮＳＯＮ产品； 纯化仪及所用软件购自ＡＫＴＡ公司； ＵＶ－７５４紫外分光光度计购自上海第三分析仪器厂； 低温超速离心机为Ｂｅｃｋｍａｎ公司产品。（二）实验方法１．稳定表达ｃＤ２０抗原的ｃＨｏ细胞的产生（１）真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＤ２０的构建 从高表达ＣＤ２０的Ｒａｊｉ细胞中克隆出人的全长ＣＤ２０ ｅＤＮＡ，连接到表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＤ２０。（２）转染ＣｌｉＯ细胞于３．５ｃｍ组织培养皿中接种３×１０５ ＣＨＯ细胞，细胞培养至９０％．９５％融合时进行转染：取质粒１０“ｇ（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＤ２０）和２０ｐｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品）分别溶于５００｝ｔｌ无血清ＤＭＥＭ培养基，室温静置５分钟，将以上２种液体混合，室温孵育２０分钟以使ＤＮＡ－脂质体复合物形成，其间用３ｍｌ 无血清的ＤＭＥＭ培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的ＤＮＡ－脂质体复合物加入到板中，Ｃ０２孵箱培养４小时后补加２ｍｌ含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全 培养基，置于Ｃ０２孵箱中继续培养。转染进行２４ｈ后细胞换含６００Ｂ∥ｍｌ Ｇ４１８的选择培养基培养２周。（３）分选阳性细胞 取上述转染细胞，加入ＦＩＴＣ―Ｃ２８８ ４＂Ｃ孵育４５ｍｉｎ，洗细胞２遍后用流式细胞分选术ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢＤ 胞。Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）．来分选高表达ＣＤ２０的阳性细２．小鼠抗人ＣＤ２０单克隆抗体的制备（１）免疫小鼠用ｌ×１０７Ｒａｊｉ细胞腹腔注射弗氏佐剂混合免疫６－８周龄ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，共免疫３―４次，每隔二周免疫一次，细胞数均为ｌｘ１０７／只，融合前３．５天，用ｌ×１０７细胞／只尾静脉注射进行加强免疫。（２）细胞融合及培养ＮＳ．１细胞和Ｉ×１０８免疫脾细胞无菌取小鼠脾细胞，制成细胞悬液，将ｌ ｘ１０７混合于５０ｍｌ离心管中，１０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ，５０％ＰＥＧ作融合剂，融合用２５ｍｌ 完全培养基将细胞悬起，滴加于两块９６孔培养扳，置３７＂Ｃ ７％Ｃ０２培养箱内培养。抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定细胞融合后，先在完全培养基中作适应性培养，２４ｈ后加ＨＡＴ选择培养基作选择性培养，第三天或第十天改为ＨＴ培养基。（３）筛选阳性克隆杂交瘤阳性克隆的筛选一般是融合后培养７～ｌＯ天，取细胞培养上清用流式 细胞术检测，筛选高表达克隆：将ＣＨＯ―ＣＤ２０细胞用１％ＦＣＳ．ＰＢＳ重悬成ｌｘｌ０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，分别加入上述杂交瘤细胞培养上清，置于４℃孵育６０ｍｉｎ，用１％ＦＣＳ．ＰＢＳ洗细胞２遍，然后再加入ＦＩＴＣ．羊抗鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）４。Ｃ孵育３０ｍｉｎ，洗细胞２遍后用ＦＣＭ分析，比较各个克隆的最大荧光强度。（４）抗体的纯化将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，收集细胞培养上清，用ＰｒｏｔｅｉｎＧ亲和柱分离纯化抗体。将纯化抗体用ＰＢＳ进行透析，最后以紫外吸收法定量。３．小鼠抗人ＣＤ２０单克隆抗体的抗原结合活性鉴定（１）用透析标记法标记抗体用０．０２５Ｍ ｐＨ９．５的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体３Ｄ９稀释成ｌ％浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将ＦＩＴＣ配成０．１ｍｇ／ｍｌ的溶液盛于小烧杯中，使透析袋 浸没于ＦＩＴＣ溶液中，在４０Ｃ避光搅拌２４ｈ。取出透析袋中标记液，用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０ 过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体ＦＩＴＣ．３Ｄ９备用。 （２）流式细胞术检测抗原结合活性将Ｒａｊｉ细胞用１％ＦＣＳ．ＰＢＳ重悬成ｌｘｌ０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，分别加入不同稀释度的单克隆抗体ＦＩＴＣ一３Ｄ９和作为对照的抗ＣＤ２０的单克隆抗体ＦＩＴＣ―Ｃ２８８（购自 Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ公司），置于４℃孵育６０ｍｉｎ，用１％ＦＣＳ―ＰＢＳ洗细胞２遍后用ＦＣＭ分析，计算染色阳性细胞的平均荧光强度并比较各抗体的相对亲和力。这里相对亲和力定义为染色阳性细胞的百分数达到５０％时所对应的抗体浓度。４．竞争抑制实验将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体ＦＩＴＣ一３Ｄ９和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Ｒａｊｉ（１×１０６／ｍ１）中，４＂Ｃ孵育６０ｍｉｎ，Ｉ％ＦＣＳ―ＰＢＳ洗细胞 ２遍，流式细胞仪检测并用Ｅｅｌｌｑｕｅｓｔ软件分析。竞争抗体的每个浓度设３个复管， 计算半数抑制浓度ＩＣ。。值。５．抗人Ｃ０２０单抗可变区基因的克隆（１）总ＲＮＡ的抽提按“Ｔｒ泣ｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ”试剂盒说明书提取２ｘ １０６分泌抗人ＣＤ２０单抗的杂交瘤细胞 ３Ｄ９的总ＲＮＡ。（２）引物设计 选择抗体（ＩｇＧｌ，１ｃ）重链和轻链恒定区的适当位置分别设计３条基因特异性引 物：ＧＳＰｌ距离可变区基因最远，用于逆转录反应，ＧＳＰ２用于首轮ＰＣＲ扩增，ＧＳＰ３用于巢式扩增。引物所处的位置见下图。ｍＲＮＡ５ｊ―――――――――――――――――――――――――――――一（Ａ）ｎ?－―－－－－一ＧＳＰ １ＡＵＡＰ―＿Ａ仙―――――＿?―一ＧＳＰ２一ＧＳＰ３ＧＳＰ：Ｇｅｎｅ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ； ＧＳＰ：Ｇｅｎｅ―ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ；ＡＡＰ：５’ＲＡＣ Ｅ ａｂｒｉｄｇｅｄ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ； ＡＵＡＰ：Ａｂｒｉｄｇｅｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ＧＳＰｌ一Ｈ’５’一ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ一３’；ＧＳＰ２．Ｈ，５’．ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ．３’： ＧＳＰ３一Ｈ．５’．ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ．３’ ＧＳＰｌ．Ｌ．５’．ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴ．３’： ＧＳＰ２．Ｌ，５’一ＴＧＴ ＣＧＴ １℃Ａ ＣＴＧ ＣＣＡ １℃Ａ Ａ１℃ＴＴ．３’： ＧＳＰ３一Ｌ ５’一ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＣＧ ＡＣＴ ＧＡ．３’． ＡＡＰ ＡＵＡＰ ５’．ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＧ ＧＧＩ ＩＧＧ ＧⅡＧＧＧⅡＧ一３’ ５’．ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ．３’（３）５＇ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）按照５’ＲＡＣＥ试剂盒说明书以ＧＳＰｌ为引物将总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮ八然后 给第一链ｃＤＮＡ的３’末端加上ｐｏｌｙ（Ｃ）尾，加尾后用ＧＳＰ２和ＡＡＰ为引物进行ＰＣＲ 扩增，将扩增产物稀释１００倍再以ＡＵＡＰ和ＧＳＰ３为引物进行巢式ＰＣＲ扩增。两次ＰＣＲ反应均采用热启动，反应条件：９４℃５分钟；９４。Ｃ ４５秒，６０。Ｃ４５秒，７２０Ｃ１分ｌＯ秒，３０个循环；７２０Ｃ ７分钟。巢式ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ ｅａｓｙ载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析，正确克隆记作ｐＧＥＭ―Ｔ～Ｈ和ｐＧＥＭ―Ｔ／ＶＬ（４）Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ以上述测序正确的ｐＧＥＭ．Ｔ／ＶＨ为模板，设计引物Ｈ正义ＡＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣＴＴＧ和Ｈ反义ＧＣＴＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣＣＡＧ，按照Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒说明书扩增ＶＨ链可变区基因并使其５’端含有限制酶位点ＨｉｎｄｌＩＩ，３’端含有限制酶位点Ｎｈｅ Ｉ，反应条件为：５０℃３０ 分：９５℃１５分钟；９４℃５０秒，５８℃５０秒，７２℃５０秒，３０个循环；７２℃ｌ ０分钟。经ｌ％琼脂糖凝胶电泳纯化回收ＰＣＲ产物并克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体中，筛选阳性克 隆测序，对测序结果进行分析，正确克隆记作ｐＧＥＭ―Ｔ／ＶＨ。 以上述测序正确的ｐＧＥＭ．Ｔ／ＶＬ为模板，设计引物Ｌ有义ＡＡＧＣＴＴＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＣＣＣＴＧ和Ｌ反义ＧＡＣＡＧＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ．１７．ＣＡＣ ＡＧＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴＧ，按照Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ―ＰＣＲ试剂盒说明书扩增ＶＬ基因并使其５’端含有限制酶位点ＨｉｎｄｌＩＩ，３’端含有人抗体轻链恒定区５’端的互补序列，反应条件为：９４。Ｃ５分钟；９４＂Ｃ ５０秒，５８。Ｃ５０秒，７２℃１分钟，３０个循环；７２℃１０分钟。经１％琼脂糖凝胶电泳纯化回收ＰＣＲ产物并克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析，正确克隆记作 ｐＧＥＭ―Ｔ／ＶＬ。（三）实验结果 １．抗原结合活性鉴定ｌＯＯ８０ 口墨６０窆。占４０２０Ｏ．１ｌ１０Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１咀ｇ／ｍ１）图２．流式细胞术检测抗ＣＤ２０鼠源抗体的抗原结合活性。抗ＣＤ２０的单克隆抗 体ＦＩＴＣ―Ｃ２８８作为对照。每个样品设三个复管。 图１结果表明，３Ｄ９与对照Ｃ２８８（Ｃｏｎｗ０１）具有相似的结合曲线，均呈浓度 梯度依赖性，浓度在１００ｎｇ／ｍｌ时开始出现结合活性，在ｌｏ，ｒｄｎａ时达饱和，说明 三者都能Ｉ－－，很Ｚ好地与Ｒａｊｉ细胞特异性结合。抗ＣＤ２０人潭化抗体的制ｉ－Ｚｔ．生物学活性鉴定２．竟争抑制实验（Ｒａｊｉ细胞）图４崩４：ＬａｎｅＩ：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ ２：３Ｄ９ＶＬ；Ｌａｎｅ３：３１３９ ＶＩＩ４．序列测定和分析测序结果显示，Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的序列与５’ＲＡＣＥ扩增产物的序 列完全一致。序列如下：３Ｄ９ＶＨ １ １ＡＧＴＧＡＧＴｃＧｃＡＴＧｃＴｃｃＧＧｃｃＧｃｃＡＴＧＧｃｃＧｃＧＧＧＡＴＴ圃ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＨｉ ｎｄｌＩＩ 术Ｖ Ａ Ｃ Ｓ Ｇ Ｒ Ｈ Ｇ Ｒ Ｇ Ｉ Ｋ Ｌ Ａ Ａ Ｔ Ｍ Ｅ６１ ２０ＧＴＡＡＣＴＧＧＡＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴ从ＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＣ Ｎ｛｜『Ｉ Ｌ Ｐ Ｆ Ｉ Ｌ Ｓ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｖ Ｙ ＳＱＶＱｓＰ●ｌ◆Ｖ。１２１ ４０ ＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧ ＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＡ￥ＲＬＳＣＫ１８１ ６０ＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴ从ＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧ（ⅪＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡ Ｓ Ｇ Ｙ Ｔ ＦＴ琴￥舅封建ｊＷＶＫＱＲＰＧ０２４ｌ ８０ＧＴＣＴＧＧ从ＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧ Ｌ Ｅ ｗ Ｉ Ｇｉ鑫。Ｉ麓Ｐ霸驽ＧＤＴＲ一￥Ｔ臻ｌ【：：ｊ３０１ １００ＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣ从ＴＴＣＡ》琵囊ＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＦ３６１ １２０ＧＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＣＣＴＡＴＧＧＴＴ Ｒ Ｓ Ｌ Ａ Ｓ Ｅ Ｄ Ｓ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ ＡＲ耪６Ａ￥露Ｎｈｅ Ｉ４２ｌ １４０ＡｃＧＡｃＧＡｃＧＧＧＡＴＧＧＡｃＴＡｃＴＧＧＧＧＴｃＡＡＧＧ从ｃｃＴｃＡＧＴｃＡｃｃＧＴｃＴｃｃＴｃＡｊＧＣＴＡＧｑＡ 羲ｐ―Ｄ、多，醒努鬟ｗＧ０ＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳ．＿ＶＨ３Ｄ９ＶＬ： １ ｌＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＧＡＴＴ圃ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＨｉｎｄｌＩＩＫ两Ｌ Ｌ Ｒ Ｐ Ｐ Ｗ Ｒ Ｐ Ｒ Ｄ Ｓ Ｉ Ｋ Ｌ Ａ Ａ Ｔ Ｍ ＧＧＴＴＴＴＣＡｃＡＣＣＴＣＡＡＡＴＡｃＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡ Ｖ Ｆ Ｔ Ｐ６ｌ ２１ＱＩＬＧＬＭＬＦＷＩＳＶＳＲ ＳＰ４ＧＤＩ◆Ｖ。１２ｌ ４ｌＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣ；ＧＡＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＧＴＣＴ Ｉ Ｖ Ｌ ＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬ１８１ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＴＴＣＧＣＡＡＣ从ＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣ从ＣＡＡＡＡＡＴＣＡＣＡ，２０―抗Ｃ１）２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ｎＳＣＲ硅，ＳＱＳＩＲＮＮＬ，嚣ＷＦＱＱＫＳＨｌＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣ从ＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＥ Ｓ Ｐ Ｒ Ｌ Ｌ Ｉ孔叭１Ｋ爹ＡＳＱＳ王蓬ＧＩＰＳＲＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣ从ＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＦ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｄ Ｆ Ｔ Ｌ Ｓ Ｉ Ｎ Ｓ Ｖ Ｅ Ｔ Ｅ∞加 ｌｌＡＧＡＴＴＴＴＧＧ从ＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣ从ＣＡＧＡＧＴ从ＣＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧｃＴＧＧＤ Ｆ Ｇ Ｍ Ｙ Ｆ％他 １Ｃ！ＱＱＳＮＳｗＰＬ．耄ＦＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡ从ＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧ 铊Ｍｌ●Ｌ Ｔ Ｋ Ｌ Ｅ Ｉ Ｋ Ｒ Ｔ Ｖ Ａ Ａ Ｐ Ｎ Ｈ，Ｉｃ木Ｉ Ｒ Ｇ ＲＶ。●将获得的３Ｄ９重链和轻链可变区基因序列输入计算机在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中检索，证明是新克隆的抗体基因。（四）讨论我们采用传统的杂交瘤技术，通过自行构建、筛选获得的自制的高表达ＣＤ２０的ＣＨＯ―ＣＤ２０细胞筛选，得到了三株高亲和力的ＣＤ２０单克隆抗体３Ｄ９。检测其抗原结合活性和与Ｒｉｔｕｘａｎ．ＦＩＴＣ竞争流式曲线。目前克隆单抗可变区基因主要是采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，这种策略基于对编码鼠可变区基因５’和３’末端保守区的认识，设计两对引物分别与这两段保守区结合，利用ＰＣＲ反应来扩增可变区基因。３’端引物可设计在抗体基因的恒定区，而５’端引 物的设计则有两种。第一种方法是将５’引物选择在可变区上游编码信号肽的ＤＮＡ 序列中，但编码小鼠抗体信号肽的序列变异较大，所以需要设计多个５’引物，而 且对于一种新的抗体分子没有完全的把握可以扩增获得其可变区。另一种方法则避免了这个缺点，它所设计的５’引物是在可变区中相对保守的第一个框架区伊Ｒ１），这样所需的５’引物要少得多，但这种方法也有一个问题，即由于５７引物位于可变 区的框架区，引物的简并性可能会导致抗体５’端残基发生改变，尽管抗体的亲和 力主要决定于ＣＤＲ区，但框架区也有一定的作用，而且即使个别氨基酸残基的改变有时也会显著地影响抗体的表达水平［２０１。近年来一种快速扩增相邻未知ｃＤＮＡ 的新方法一ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡ ｅ１】ｄｓ）策略［２１’２７】得到广泛应用，其优点是快速、简便，只需知道ｃＤＮＡ内很短的一段序列即可扩增出其５’端（５’ＲＡＣ Ｅ） 或３’端（３’ＲＡＣＥ）。因为抗体基因下游的恒定区序列已知，我们采用５’ＲＡＣＥ的 方法来获耿单抗３Ｄ９的可变区基因，结果证明这种方法可行，而且避免了直接采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆抗体可变区序列中可能出现的问题，方便地获得了全长的抗体可变区序列，经与ＧｅｎＢａｎｋ公布的基因序列进行同源性比较后证实为新的抗体 皋因。抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定第二部分ＣＤ２０鼠／人嵌合抗体的构建由杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应 答ｈｕｍａｎａｎｔｉｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＨＡＭＡ）【２１，成为鼠源单抗广泛应用的障碍。嵌合抗体是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区融合而成【５１，由于这两部分在空间结构上相对独立，其抗原亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一定的下降。因此，通过基因工程技术构建嵌合抗体可以降低鼠源抗体的免疫原性，有 效地减少ＨＡＭＡ反应的发生率。我们将制备的一株鼠源ＣＤ２０单克隆抗体改造获得嵌合抗体。（一）１．实验材料 菌株、细胞株菌株：大肠杆菌ＴＧｌ由本室传代保存。 细胞株：ＣＨＯ．Ｋ１细胞株由本室保存； Ｒａｊｉ购自ＡＴＣＣ，由本室保存。２．引物及工具酶ＰＣＲ引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司和上海生工生物工程技术服务有限公司合成； 限制性内切酶及Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ均购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司； ＢＲＬ公司。Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ购于美国Ｇｉｂｃｏ３．ＤＮＡ分子量标准ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＨｉｎｄＩＨＭａｒｋｅｒ及ＥｃｏＲＩ Ｍａｒｋｅｒ为华美公司产品。４．细菌培养及其它试剂胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉为英国ＯＸＯＩＤ公司产品； 琼脂糖及其他相关试剂购自实生公司；淋巴细胞分离液：鼎国生物技术发展公司产品。细胞培养及转染试剂新生小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品；ＲＰＭＩ一１６４０培养基和ＤＭＥＭ培养基均为ＧＩＢＣＯ公司产品；透析胎牛血清购自ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ公司；细胞冻存液：３０％胎牛血清＋１０％ＤＭＳＯ＋６０％无血清培养液，过滤除菌； Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，无血清培养基ＯＰＴＩ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。６．抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＦＩＴＣ―ｇｏａｔａｎｔｉ－ｈｕｍａｍＨＲＰ―ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）购自Ｚｙｍｅｄ公司；ＨＲＰ―ｇｏａｔａｎｔｉ－ｈｕｍａｎｋａｐｐａ购自Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ公司；Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＩｇＧ（Ｆｃ）购自ＫＰＬ公司；Ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｍａ ＩｇＧｌ，ｋａｐｐａ购自Ｓｉｇｍａ公司。 ７．试剂盒Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｒｏｃｈｅ公司；ｐＧＥＭ―Ｔ ｖｅｃｔｏｒ购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｔｒｉｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖｅｃｔｏｒ及ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）ｖｅｃｔｏｒ均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；小量质粒抽提纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。８．超滤装置及纯化柱１０ｋＤａ超滤膜包为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品； Ｐｒｏｔｅｉｎ―Ａ亲和层析柱购自ＧＥ公司。 ９．主要仪器设备ＰＣＲ仪：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品； 复日ＦＲ－９８０生物电泳图像分析系统：上海复日生物实验技术研制所产品；细菌培养摇床：上海离心机械研究所产品；抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定细胞培养瓶：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品； 细胞培养箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品； 生物安全柜：造鑫公司产品； 离心管和流式管：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品； ＸＤＳ―ｌＢ型显微镜：重庆光学仪器厂产品； 一８０℃低温冰箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品； ＤＫ一６００型恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司产品； Ｃ２８８０Ｒ台式低温离心机：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品； 流式细胞仪（ＦＡＣＳｃａｎ）：ＢＤ公司产品； 超声仪为上海ＢＲＡＮＳＯＮ产品； 纯化仪及所用软件购自ＡＫＴＡ公司； ＵＶ－７５４紫外分光光度计购自上海第三分析仪器厂；Ｓｐｅｃ仃ａｌＩ酶标仪：ＳＬＴ公司产品。（二）１．实验方法 入抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Ｔｒ娩ｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，根据文 献【２８】【２９】报道的序列分别设计引物ＣＨ正义ＧＣＴ引物ＣＨ反义ＴＴＴＡＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＣＡＴＣ和ＡＣＣ ＧＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ，采用ＰＣＲ反应扩增抗体重链和轻链恒定 ４５区基因。ＰＣＲ反应均采用热启动，反应条件：９４０Ｃ ５分钟；９４０Ｃ ４５秒，６００Ｃ秒，７２０Ｃ １分１０秒，３０个循环；７２０Ｃ １０分钟。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆，记作ｐＧＥＭ―Ｔ／ＣＨ和ｐＧＥＭ－Ｔ／ＣＬ。２．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的真核表达载体的构建（１）重链表达载体的构建将３Ｄ９重链可变区基因ｐＧＥＭ．Ｔ／Ⅶ用ＨｉｎｄＩＩＩ和ＮｈｅＩ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约４３０ｂｐ的酶切片断，与同酶切的质粒ｐＧＥＭ．Ｔ／ＣＨ连接，挑选正确克隆后以ＨｉｎｄｌＩＩ和ＥｃｏＲ Ｉ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段， 与同酶切的质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶进行连接，构建成真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）。（２）轻链表达载体的构建 采用Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ将３Ｄ９轻链可变区基因ｐＧＥＭ．Ｔ／ＶＬ直接与轻链恒定区的正确克隆ｐＧＥＭ．Ｔ／ＣＬ融合，反应条件为：５０℃３０分；９５℃１５分钟；９４℃５０ 秒，５８℃５０秒，７２。Ｃ ５０秒，３０个循环；７２℃１０分钟，得到ＰＣＲ产物ＶＬＣＬ，其５’端含有限制酶位点ＨｉｎｄＩＩＩ，３’端含有限制酶位点ＥｅｏＲ Ｉ。经琼脂糖凝胶电泳纯化 回收ＰＣＲ产物并克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的ＶＬＣＬ基因用ＨｉｎｄｌＩＩ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶消化从ｐＧＥＭ．Ｔ载体中切下，克隆到ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋） 载体中，构建成真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）。３．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的表达及纯化（１）嵌合抗体的稳定表达于３．５ｃｍ组织培养皿中接种３×１０５ ＣＨＯ．ＫＩ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９６１８）细胞，细胞培养至９０％一９５％融合时进行转染：取３Ｄ９质粒１０１．ｔｇ（质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＩ－Ｉ）４ｐ，ｇ，质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）６Ｉ，ｔｇ）和２１ｘｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（１ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品）分别溶于５００“１无血清ＤＭＥＭ培养基，室温静置５分钟， 将以上２种液体混合，室温孵育２０分钟以使ＤＮＡ－脂质体复合物形成，其间用３ｍｌ无血清的ＤＭＥＭ培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的ＤＮＡ－脂质体复合物加入到板中，Ｃ０２孵箱培养４小时后补加２ｍｌ含１０％血清的ＤＭＥＭ完全抗Ｃ０２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定培养基，置于Ｃ０２孵箱中继续培养。转染进行２４ｈ后细胞换含６００ｐｇ／ｍｌ Ｇ４１８和２５０９９／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ＥＬＩＳＡ检测筛选高表达克隆：羊抗人ＩｇＧ（Ｆｃ）包被于ＥＬＩＳＡ板，４０Ｃ过夜，用２％ＢＳＡ．ＰＢＳ于３７０Ｃ封闭２ｈ，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品（ＨｕｍａｎｍｙｅｌｏｍａＩｇＧｌ，Ｋ），３７０Ｃ温育２ｈ，加入ＨＲＰ一羊抗人ＩｇＧ（ｎ）进行结合反应，３７０Ｃ温育ｌｈ，加入ＴＭＢ于３７０Ｃ作用５ｍｉｎ，最后用Ｈ２Ｓ０４终止反应，测Ａ４５０值。（２）嵌合抗体的纯化 将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ亲和柱分离 纯化嵌合抗体Ｃ３Ｄ９。将纯化抗体用ＰＢＳ进行透析，最后以紫外吸收法定量。４．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的鉴定（１）抗原结合活性检测 将Ｒａｊｉ细胞用Ｉ％ＦＣＳ．ＰＢＳ重悬成ｌ ｘｌ ０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，分别加入不同稀释度的单克隆抗体Ｃ３Ｄ９，置于４℃孵育６０ｍｉｎ，用１％ＦＣＳ．ＰＢＳ洗细胞２遍，再加入ＦＩＴＣ一羊抗人ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）于４。Ｃ孵育６０ｍｉｎ，洗细胞后用ＦＣＭ分析。 （２）竞争抑制实验 将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体ＦＩＴＣ一３Ｄ９，和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Ｒａｊｉ（１ｘ １０６／ｒｎｌ）中，４℃孵育６０ｍｉｎ，Ｉ％ＦＣＳ．ＰＢＳ洗细胞２遍，流式细胞仪检测并用Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ软件分析。Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ作为对照。竞争抗体的每个浓度设３个复管，计算半数抑制浓度ＩＣ５０值。（三）实验结果５．人抗体轻、重链恒定区的核苷酸和氨基酸序列（１）人抗体重链恒定区（ＣＨ）的核苷酸序列ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ ＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣ ＡＣＣ ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣ ＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣ ＴＧＣＣ ＴＧＧＴＣ ＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣ ＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴｒＣＣ ＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡ ＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣ ＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡｒＣＡＣＡＡＧＣＣＣ ＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴｒＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣ ＡＡＡＡＣ ＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣ ＴＴＣＣ１℃Ｔ］ｆＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣｌｆＣＡＴＧＡ］ｆＣｌｆＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴ℃ＡＣＡ脱ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴｃＡＡＧＴＴＣＡＡＣ ｍＡｒＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣ ＡＣＧｒＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴｃＡＧＣＧｌ℃ＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣ ＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧ（ⅪＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡ（订＇ＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣ ＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡ：ｒＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧ旧ＡＴＧＡＧＣ ＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡ（Ｋ；ＣＴＴＣＴ盯ＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡｒＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡｒＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣ １’ＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣ（℃Ｃ１℃ＣＣＧＴ（记ＴＧＧＡＣ １℃ＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴｒＣＴＴＣＣＴＣｌ：ＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡ ＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴｒＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡ ＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣ ＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＡ（２）人抗体重链恒定区（ＣＨ）的氨基酸序列ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳⅥｒｌｑＳＧＡＬＪＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱｓＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ，２８?抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＩＵ甲ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ、＾ｒＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧ ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳ ＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（３）人抗体轻链恒定区（ＣＬ）的核苷酸序列ＡＣＴＧＴＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣ ＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴｒＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡ芦ｌＴＡＡＣＴＴＣＴ芦江℃ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡ ＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴ ＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡ ＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣｌ：：ＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡｒＣＡＧ（Ｋ℃ＣＴＧＡ（记ＴＣ ＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣ ＴＴＣＡＡＣ ＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ（４）人抗体轻链恒定区（ＣＬ）的氨基酸序列ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ６．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的真核表达载体的构建将测序正确的重、轻链基因用ＨｉｎｄｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ双酶消化从ｐＧＥＭ．Ｔ载体中切下，分别克隆到ｐｃＤＮＡ３．１（＋）载体和ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）载体中，构建成真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）和ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）。然后再经ＨｉｎｄｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ双酶 切鉴定，筛选出正确的真核表达载体克隆。一２９―星＝工■］一一、＿＿，■＿＿Ｉ．一Ｉ图１图１：Ｌａｎｅｌ：ＨｉｎｄｌｌｌＭａｒｋｅｒ；ＬａｎｅＬａｍ ２：Ｃ３Ｄ９［ｐｃＤＮＡ３ ｌ（＋）（ＶＨＣＨ）】，４：ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａ血ｅｒ３：Ｃ３Ｄ９【ｐｃＤＮＡ３ Ｉ／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣ Ｌ）］；Ｌａｎｅ经Ｉ％琼脂糖凝胶电泳分析，嵌合抗体（Ｃ３Ｄ９）的重链均出现在２０００ｂｐ左右， 轻链均出现在７５０ ｂｐ左右，ｐｃＤＮＡ３ Ｉ（＋）载体和ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）载体出现在５０００ ｂｐ矗：有，这与测序的结果一致。７．３Ｄ９可变区氨基酸和碱基３Ｄ９Ｈ氨基酸ＫＬＡＡＴＭＥＣＮＷＩＬＰＦＩＬＳＶＴＳＧＶＹＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱｐＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹ ＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＳＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＲＡＴＬＳＡＤＫＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬ ＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＡＹＧＹＤＤＧＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳ３Ｄ９Ｈ碱基：ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＴＡＡＣＴＧＧＡＴＡＣ＂ＩＴＣＣＴＴＴＦＡＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡ ＣＴＦＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴｌ℃Ｔ（ｍＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴｏｏＧＧＣＴＡＴＴＬ婀Ｃ１ＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣ抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定ＡＡＧＧＣＣＡＣＡｒＴＧＡＣＴＧＣＡＧｍＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣｌ：ＡＣＡＴＧＣＡＡＴＩ℃ＡＧＧＡＧＴＴｒＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣ ＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣ ＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＣＣＴＡＴ ＧＧＴｒＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＡｒＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣ ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣ ＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣ ３Ｄ９Ｌ氨基酸ＫＬＡＡＴＭＶＦＴＰＱＩＬＧＬＭＬＦＷＩＳＶＳＲＧＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＲＮＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰⅧ＜ＳＦＮＲＧＥＣ木ＥＦ３Ｄ９Ｌ碱基ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴｒＣ ＡＣＡＣＣＴＣＡＡＡｒＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＧＣＴ ＴＴＴＴＴ ＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＴＡＴＣＧＴＩ℃Ｔ＇ＧＡＣＧＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣ ＣＧＣＴｒＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣ灯ＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＡＡＡ（、１＇ＡＣＧＣＣＡＧＴＣ ＡＧＡＧＣＡｒＴＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＣＧＴＣＴＣ ＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣ ＴＣＣＧ ＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣ Ｔｒ℃ＡＣＴＣ ＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣ ＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＣ ＡＡＣＧＴＡＣＴＡＣ ＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＴＣＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡ ＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＣＡＣＴＧＴ．ＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＩ℃ＴＴＣＣＣＧＣ ＣＡｒＣ １１ＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡ Ａ Ａ１℃ＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣ ＴＧＡＡｒＡ ＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧｌ：ＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡ ＡＣ ＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴ ＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡｃＣＴＡ ＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡ ＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣ１＿ｒ℃ＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴｒＡＧＧＡＡＴＴＣ．３ｌ一８．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的抗原结合活性盘 畏 。窆口 食 ｏｏ图２．ＣＤ２０嵌合抗体Ｃ３Ｄ９与Ｃ２８８抗原结合活性比较。实验结果表明，Ｃ３Ｄ９ 的结合活性明显高于Ｃ２８８。９．竞争抑制试验１００８０，气迫◇ｅ６０三４０ ｏ叻叫啐２００ ¨ １００ ２００ ３００ ４００ ５００ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｎｇ／ｍ１）图３．嵌合抗体Ｃ３Ｄ９的竞争抑制试验．试验结果表明，嵌合抗体Ｃ３Ｄ９和鼠源抗体３Ｄ９都能阻断ＦＩＴＣ一３Ｄ９与Ｒａｊｉ细胞的结合，而对照ｈｕｍａｎ ＩｇＧ不能阻断其 结合。抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定（四）讨论在单克隆抗体的基础上，我们构建了Ｃ３Ｄ９这株嵌合抗体，其具有较低的ＨＡＭＡ反应。实验结果表明，其具有较好的生物学活性。鼠源单克隆抗体作为异源性蛋白质在人体内可诱发抗鼠抗体的产生，因而限 制了鼠源单抗在临床治疗的广泛应用。基因工程抗体技术通过抗体基因的改造，对抗体分子的分子大小、亲和力高低、细胞毒性的强弱均根据所制备生物制剂的需求进行设计和操作，这是用杂交瘤技术所不能实现的。在目前众多的基因工程 抗体的研制方案中，嵌合抗体是一种较为成熟的基因工程抗体。嵌合抗体是指通过 基因工程的技术和方法，将鼠源单抗可变区与人抗体恒定区拼接形成的抗体【３ｌ】。这 种抗体相对于其它人源化抗体的优点在于技术路线简单，易于操作；抗体完整性好，在体内的半衰期延长；鼠源抗体的亲和力和特异性都得到了保留，在临床上具有良好的应用前景。目前已有超过２０种嵌合抗体进入临床试验阶段，如已经通过ＦＤＡ批准用于临床治疗的抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｒｉｔｕｘｉｍｂ【３２】、抗ＴＮＦ嵌合抗体Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ［３３】等。本课题中我们将ＣＤ２０单抗的可变区与人抗体的恒定区连接，获 得了一株亲和力高于鼠源抗体，具有一定生物学功能的嵌合抗体Ｃ３Ｄ９，表明嵌合抗体的构建是成功的。第三部分０Ｄ２０人源化抗体的构建及生物学活性鉴定鼠单克隆抗体的人源化，是为克服鼠源单抗的免疫原性而将其进行改造，使之 和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人体免疫系统的识别，避免诱 导ＨＡＭＡ反应。进行抗体的人源化有两个基本原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或基本消除抗体的免疫原性。抗体的人源化技术有多种方案，但必须遵循这两个原则。嵌合抗体完整地保留了鼠源单抗特异结合抗原的Ｖ区，去除了非人源序ＹＪＪ（Ｃ区），因此最大限度地保持了其亲和活性，可作进一步改造的亲和力参照体。但由于其整个Ｖ区都是异源的，在进行临床试用时仍能够被人体的免疫 系统所识别产生ＨＡＭＡ反应【３４１，因此有必要对鼠单抗可变区进行进一步的人源化 改造。我们利用计算机辅助设计对ＣＤ２０单抗３Ｄ９进行人源化改造，进一步减少 鼠源成分，以降低其免疫原性。（一）１．实验材料 菌株、细胞株菌株：大肠杆菌ＴＧｌ由本室传代保存。 细胞株：ＣＯＳ．１和ＣＨＯ．ＫＩ细胞株均由本室保存； 人的急性髓性白血病细胞系Ｒａｊｉ购自ＡＴＣＣ，由本室保存。２．引物及工具酶ＰＣＲ引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司和上海生工生物工程技术服务有限公司合成；限制性内切酶及Ｔ４Ｔａｑ ＤＮＡ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ均购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ购于美国Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ公司。３．ＤＮＡ分子量标准Ｍａｒｋｅｒ―ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、ＨｉｎｄＩＨ Ｍａｒｋｅｒ及ＥｃｏＲｌ Ｍａｒｋｅｒ为华美公司产品。４．细菌培养及其它试剂胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉为英国ＯＸＯＩＤ公司产品；抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学活性鉴定琼脂糖及其他相关试剂购自实生公司。５．细胞培养及转染试剂新生小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品； ＲＰＭＩ．１６４０培养基和ＤＭＥＭ培养基均为ＧＩＢＣＯ公司产品；透析胎牛血清购自ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ公司；细胞冻存液：３０％胎牛血清＋１０％ＤＭＳＯ＋６０％无血清培养液，过滤除菌； Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，无血清培养基ＯＰＴＩ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。６．抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＦＩＴＣ―ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｍ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）购自ＺｙｍｅｄＨＲＰ―ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ公司；ＨＲＰ―ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎｋａｐｐａ购自Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ公司；ＩｇＧ（Ｆｃ）购自ＫＰＬ公司；Ｈｕｍａｎ７．ｍｙｅｌｏｍａ ＩｇＧｌ，ｋａｐｐａ购自Ｓｉｇｍａ公司。试剂盒Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｒｏｃｈｅ公司；ｐＧＥＭ―Ｔ ｖｅｃｔｏｒ购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｔｒｉｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖｅｃｔｏｒ及ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）ｖｅｃｔｏｒ均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；小量质粒抽提纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。８．超滤装置及纯化柱１０ｋＤａ超滤膜包为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品；Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ亲和层析柱购自ＧＥ公司。９．主要仪器设备ＰＣＲ仪：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品；复同ＦＲ－９８０生物电泳图像分析系统：上海复日生物实验技术研制所产品；细菌培养摇床：上海离心机械研究所产品； 细胞培养瓶：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品； 细胞培养箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品；生物安全柜：造鑫公司产品；离心管和流式管：美国Ｆａｌｃｏｎ公司产品； ＸＤＳ．１Ｂ型显微镜：重庆光学仪器厂产品； ．８０℃低温冰箱：美国ＲＥＶＣＯ公司产品；ＤＫ．６００型恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司产品； Ｃ２８８０Ｒ台式低温离心机：美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品；流式细胞仪（ＦＡＣＳｃａｎ）：ＢＤ公司产品； 超声仪为上海ＢＲＡＮＳＯＮ产品；纯化仪及所用软件购自ＡＫＴＡ公司；ＵＶ－７５４紫外分光光度计购自上海第三分析仪器厂；ＳｐｅｃｔｒａｌＩ酶标仪：ＳＬＴ公司产品。（二）实验方法 １．鼠源３Ｄ９单抗可交区（Ｆｖ）三维结构的同源模建利用Ａｃｃｅｌｒｙｓ公司的Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ程序包来模拟３Ｄ９鼠源单抗可变区的三维结构。首先，用ＢＬＡＳＴ程序在蛋白质结构数据库（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ，ＰＤＢ）中分别搜索３Ｄ９重链和轻链可变区的模板蛋白，我们选取同源性最高的抗体１ＦＨ５和 ２Ｅ２７分别分别作为３Ｄ９轻链和重链的模建模板，利用Ｉｍｉｇｈｔ ＩＩ程序模建出３Ｄ９ 的三维结构。２．３Ｄ９人源化抗体的设计与构建（１）人源化抗体的设计 首先用ＢＬＡＳＴ程序在Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中分别搜索与３Ｄ９轻链和重链可变区 最相似的人源模板，分别选择人免疫球蛋白重链ＩＩＩ亚组（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ ｓｕｂｇｒｏｕｐＩＩＩ抗ＣＤ２０人源化抗体的制备及生物学’活．睦鉴定（ｈｕｍＩＩＩ））和ＩｇＫ链Ｉ亚组（１ｉｇｈｔｃｈａｉｎ ｋ ｓｕｂｇｒｏｕｐＩ（ｈｕｍｋＩ））的一致序列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）作为３Ｄ９抗体轻重链的人源化模板，同源性分别为５２％和６３％。然后，我们分别采用人免疫球蛋白重链ＩＩＩ亚组和ＩｇＫ链Ｉ亚组作为３Ｄ９重链和轻链人源化的模板，将３Ｄ９的重链和轻链ＣＤＲ区分别移植到人源模板人免疫球蛋白重链ＩＩＩ亚组和ＩｇＫ链Ｉ亚组上，构成ＣＤＲ移植抗体，重链标记为Ｈ３Ｄ９ＶＨａ，轻链标记 为Ｈ３Ｄ９ＶＬａ。 由于抗体ＦＲ区不仅参与ＣＤＲ区的空间构成，有的直接参与抗原抗体的相互结合，所以简单的ＣＤＲ移植往往会破坏抗体与抗原的作用，使抗体的亲和力大大}