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&&求助！！！双酶切连接不上这是为什么
求助！！！双酶切连接不上这是为什么
实验想要让一个7000左右bp的质粒载体变小一点，所以用Kpn1和Not1双酶切，切下一个400bp左右的片段，跑胶，但是看不到400bp的条带，然后In-fusion连上一个20bp左右的片段，然后转化，涂板子，都不长菌，这是说明我的双酶切没成功还是没有连上那个20bp的片段，我要怎样改进实验呢？求指导！都重复实验好几次了，都成功不了啊！
做了转化也没有成功，长的都是background,不是我构建的质粒
我分别做了Kpn1和Not1的单酶切，跑胶可以看出来是切成功的，但是一做双酶切就失败
质粒测过序，是没有问题的，这样还需要进行纯质粒的转化吗
刚接触这方面啊，不专业，那我应该怎样描述
酶切体系 载体 6ul
& && && && & Not1 1ul
& && && && & buffer 5ul
& && && && & 水& &38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切
目的片段通过退火得到的，有酶切位点
感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做过转化
双酶切应该是都加在一个体系的吧，我们之前做的都是把两种酶加在一个体系中，各加1uL，酶切完直接跑电泳看看，切出条带了的就做纯化。我不知道你这样一个一个切会不会有影响
我之前做单酶切也比较多，单酶切后如果不做去磷酸化处理，很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况，你先用not1切，相当于一个单酶切，容易出现各种问题，我建议还是两个酶加在一起，做一个双酶切体系试试
两个酶的Buffer不一样，所以没法一次双酶切
就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切:(:(:(
一般来说，两种酶能找到通用缓冲液，takara的公司目录上就有双酶切反应的通用缓冲液的使用表。你看能不能找到
双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其 buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行，
我是这么认为的，从电泳来看，你并没有酶切成功，但是在没有酶切开来的情况下，你用这个产物进行连接转化，就算没有连接成功，那其中也还有环状质粒，这种情况下也没有长菌斑的话，那转化本身效率就有问题，所以做纯质粒转化只是一个排查问题的过程。当然，你最重要的还是要先将质粒切开。我也没有试过两种酶依次做的双酶切，所以对你这种方法不太了解，是否会有酶切开来的粘性末端自连的情况。可以尝试下双酶切体系嘛。
这说明你可能根本就没有链接上目的片段，你双酶切的可能是空载或链接有杂基因～只是猜想。
是做infusion后转的吗？你做个酶切完的直接化转，看看长不长啊。如果张很多，那就是没切开。
今天去试一下:cry::cry:
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