5'5 race扩增有杂带 如何使用 何时使用

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《上古卷轴5》脸型MOD导入图文教程 脸型MOD怎么用
18:21:05 来源:3DM论坛 作者:jiushuzheyuanmo
  《上古卷轴5》脸型MOD怎么用?很多玩家表示遇到漂亮的脸型MOD很想使用,但不知道具体的操作步骤。今天小编带来的是“jiushuzheyuanmo”分享的《上古卷轴5》脸型MOD导入图文教程,希望对大家有帮助,一起来看吧。
RaceMenu脸型导入方法
  RaceMenu捏脸档,Head文件放到Skyrim\Data\SKSE\Plugins\CharGen,Preset文件放到Skyrim\Data\SKSE\Plugins\CharGen\Presets
  1、按~,输入【showracemenu】进入捏脸界面。选择右上角的【预设】,然后【按F5】进行预设保存,【按E】保存。
  2、选择右上角的【造型】,【按F5】打开保存菜单,【按E】保存
ECE脸型导入方法:
  1、首先,如果你安装了RaceMenu,请先卸载。不然ECE无法使用。
  (NMM安装的就NMM卸载;使用整合包的请用压缩软件打开整合包的ECE文件夹,对比文件,删除Skyrim\Data文件夹下的相应文件)
  2、安装ECE1.4,安装程序:
  3、进入游戏,按~,输入【showracemenu】进入捏脸界面→找到【预设】→读取预设,ECE捏脸档放到 我的文档\My Games\Skyrim\CME_save)
  4、比上面的简单多了,打开捏脸界面一看就知道该怎么弄。
  5、卸载ECE,安装RaceMenu,懒得卸载,同时有不在意可能会有的BUG的,比如我,可以不用卸载。 修正:如果想用第一种方式,需要ECE,所以要用第一种方式的不要卸载,RaceMenu安装程序:
  6、按~,输入【showracemenu】进入捏脸界面。选择右上角的【预设】,然后【按F5】进行预设保存,【按E】保存。
  7、选择右上角的【造型】,【按F5】打开保存菜单,【按E】保存
  注意:本教程使用的方式,原理是读档后的脸型BUG。即读档后,只要装有相应的脸型、发型、眼睛等MOD。就能能读档出一个一模一样的脸型来。
其他MDO安装教程:
  MOD安装视频教程:
  Steam工作坊Mod安装图文教程:
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我最近在扩一个基因的5‘端,扩了几次都没有得到目标条带,什么条带都没有,现在附上我做5‘race的方法,希望各位前辈高人给予指点,非常感谢谢谢!
1:反转录:用的我自己设计的5’特异性的反向引物,体系为:&&RNA& && && &&&1u
& && && && && && && && && && && && && && && && && && && && && && && & 反向引物& && &0.75u
先于70度变性10min,冰上2min,再加以下:
& && && && && && && && && && && && && & RNaseI& && && && &0.25u
& && && && && && && && && && && && & 5*M-MLV buffer& && & 2u
& && && && && && && && && && && && &&&2.5mM&&dNTP& && && &1u
& && && && && && && && && && && && && && && &M-MLV& && && &0.5u
& && && && && && && && && && && && && && && &&&DEPC 水& & 4.5u
2:反转录结束后,加入1uRNase&&37度&&30min 除去RNA,防止干扰TdT的反应。
3:按胶回收试剂盒方案进行CDNA回收纯化,得到CDNA产物。
4:按下体系和程序进行CDNA末端加尾
5*TdT&&buffer& && && &&&5u
10mM&&dCTP& && && && &1.25u
CDNA& && && && && && && && &10u
DDW(水)& && && && && && & 5.75u& && &&&
配置好后94度3min--冰上1min--加入05uTdT和2.5u& &0.1%BSA--37度30min---65度灭活10min。
5:以步骤4产物为模版,用带有多个的引物和我自己设计的反向引物扩增5‘基因。
体系如下:
10*PCR&&buffer& && && && && &&&2u
&&dNTP& && && && && && && && && && &0.8u&&
&&通用引物
(5'- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3')& && && && && &&&0.8u
&&反向引物& && && && && && && && & 0.8u
&&加尾的cDNA& && && && && && && &4u
&&DMSO& && && && && && && && && & 0.8u
&&rtap& && && && && && && && && && && & 0.2u
&&DDW& && && && && && && && && && && &9.4u
1:PCR中我没有另外加Mg2+,我们用的rtap酶和buffer中有酶,所以都没有另外加它,
2:以上所有温度方面的控制都是再PCR仪中进行的,而且都有热盖,
3:我自己设计了3条反向引物,也做了巢式PCR结果都没啥条带!
呵呵,我做我自己的5'RACE就花了1年多,做了总共不下200轮PCR,到现在没做出来。
后来因为时间赶了,就直接从转录组里调数据,直接扩出整个ORF,5'RACE等有时间再做。
提自己的几点建议吧:
1、你用的特异引物反转录,反转录效果你检测了没有?如果反转录都没有成功,后面这么多步骤都是徒劳的!我后来也是一直用特异引物做反转,检测过证明反转录没问题才往下做;
2、u指的是微升吧?不知道你用的是什么反转录试剂盒, ...
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呵呵,我做我自己的5'RACE就花了1年多,做了总共不下200轮PCR,到现在没做出来。
后来因为时间赶了,就直接从转录组里调数据,直接扩出整个ORF,5'RACE等有时间再做。
提自己的几点建议吧:
1、你用的特异引物反转录,反转录效果你检测了没有?如果反转录都没有成功,后面这么多步骤都是徒劳的!我后来也是一直用特异引物做反转,检测过证明反转录没问题才往下做;
2、u指的是微升吧?不知道你用的是什么反转录试剂盒,我做反转录一般RNA的上样量都不超过1微克,你以1微升来算;
3、我觉得纯化和加尾两个步骤对模板的损耗都是相当大的,后来我自己也是做完一步就检测模板还能不能用;
4、这些步骤中我倒是有一步是没有做的,就是加RNase消化RNA;
5、做race,运气很重要吧,或者说RP,我做这个基因的3'就两轮pcr搞定,就这个5'搞得我晕头转向,加油吧。
虽然我把orf调出来了,不过不拿到5’-utr我还是相当不甘心
剩下一年时间了,希望能把它干出来
该用户从未签到
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非常感谢2楼的意见!
1:请问一下怎么检测反转录有没有问题?没做过。
2:u是指的微升,我师姐说可能是我加dCTP这步有问题,请问一下你在做这一步时的体系和加的各个组分的量是不是和我一样?有没有那些要特别注意的呢?
非常感谢!
该用户从未签到
好。。。。
该用户从未签到
学习了!很好
该用户从未签到
该用户从未签到
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RACE可愁死我了!
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5‘RAce咋那么难做呢
该用户从未签到
同发愁中。。。
美开发细菌制造生物燃料技术电泳单引物跑出来为什么是这个样子电泳单引实时荧光定量PCR出现很多乱峰,求大神们帮亲水涂层设备迪申生物开学促销季:各规格预制胶,丙烯酰
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逛了这许久,何不进去瞧瞧?5’RACE-学术百科-知网空间
与"5’RACE"相关的文献前10条
cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是一种对mRNA进行末端快速扩增的技术,具有快速、稳定、成功率高等优点。阐述了经
RACE技术是一种快速高效克隆基因5′末端和3′末端的方法,是获取基因全长的主要手段之一,但是RACE技术本身也存在一些缺点。我们在前人改良的RACE技术基础上进一步优化RACE
cDNA末端快速扩增—RACE(rapid amplification of cDNA ends),是近年发展起来的快速有效的获得全长cDNA的途径之一。本文阐述了RACE的历史
Wire race ball bearings have been widely used in high-tech weapons. The preload of a wire
目的研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5’RACE的技术的特点,并对它们进行了优化。方法以播娘蒿RNA为模板,先按文献标准方法进行5’RACE,然
首先根据Fe(Ⅱ )
转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物 (F1,R1) ,扩增出 4 90bp的特异片段 .然后根据RACE法原理 ,巧妙地设计 3′RACE(
目的:克隆75AEST全长cDNA序列。方法:抽提在25mmol/L KCl条件下培养7d的大鼠小脑颗粒神经元的总RNA后,用DNA连接酶介导的5’RACE法克隆75A表达序列标
正Three hundred and forty-two mono-conidial isolates were obtained from rice blast specime
在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次
cDNA的末端快速扩增(RACE)是获得全长cDNA的有效手段之一.综述了RACE技术的原理、局限性、方法改进和新型RACE技术以及RACE在植物基因克隆上的相对优势、应用现状和
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【求助】5‘RACE二扩弥散
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上周二抽的RNA,纯度1.98,模板稀释到100微升的。
做touchdown,
一扩: 模板2&&LAtaq 0.1&&buffer2&&dNTP0.7&&引物各3,20微升体系
二扩:pcr产物做梯度稀释:原液、10倍、100倍,500倍,体系中加1微升模板,其余不变。
完了跑胶一片弥散,而且除了原液和10倍稀释以外其他连弥散都没有。
请教各位大,
1、touchdown延伸要求2min,是不是可以调整下,1min可以不?我的5'end预计不会超过1K。
2、是否怀疑模板的问题?用的oligodG接头。有听说做单引物不用接头效果也很好,下次想试试。
3、稀释度或者稀释操作出问题?
4、还是不用touchdown,做一做Tm梯度跑跑引物来做?
附二扩电泳图一片查看完整版本请点击这里:
3.15 5&#039;巢式第二轮.jpg
3.24 5&#039;巢式第二轮.jpg
04906 ( 11:07:30)
求教:二扩是做了NUP通用巢式单引物做对照,两者都还是拖带,左边是样品,右边是单引物对照,除了引物可能特异性不强,我一扩是没有稀释加1ul直接二扩,是不是模板也比较杂,因为看到单引物对照也是拖带,想求这个的解释。。。程序依旧TD,72度延伸1min,最后一轮29个循环。
附一扩结果,如下图
3.24 5&#039;巢式第一轮.jpg
04906 ( 11:07:58)
这个是RNA跑的胶,点了3微升:
3.22 RNA.jpg
kswl870 ( 11:08:57)
如果预测的待扩序列不超过1Kbp,就没必要用2min的延伸了,1min足够(普通聚合酶的延伸速度在60nt/s以上,高保真酶可能低些),延伸太久、循环数多,对酶活损耗大。
单特异性引物扩增5'?楼主可否提供信息来源?很有兴趣探讨一下,呵呵。
至于用不用touchdown或者touchdown的条件,甚至你要touchup都是可以不断尝试的,RACE看运气吧,有时候不稍半点功夫就成功,也有花了1年多2年的都钓取不出来的。
至于模板,楼主可以用之前扩增中间片段的一个sense primer和现在扩增5'的antisense primer(或其他合适的引物)进行验证。
leifengta ( 11:09:21)
我硕士阶段用的cloneteq的smart RACE,我没有用touchdown 不过也用的两轮扩增我的方法很好用~朋友拿这个方法都做出来了,第一轮只扩20个循环,退火温度65, 第二轮用第一轮的模板可稀释也可以不稀释,引物用inner的特异引物,5‘如果试剂盒里有inner的也可以换成inner的,这样两边都增加特异性,扩增30个循环足够了,至于退火温度可以摸索60-68,那个试剂盒要求68度的,延伸按照1min=1kb来算,看目的条带的大小。希望对楼主有帮助!
04906 ( 14:47:52)
非常感谢楼上两位!
首先单引物扩不是用oligodG加通用接头的方式得到的专门5'end模板,而是用3'end的模板在PCR时接头再继续扩增。不知道这样说明白吗?只是稍有了解,但不是我实验室的常规做法,所以没深入。
今天重新跑了一下,延伸调到1min,依旧拖带,试了一个比较久之前的没消化直接RT的模板,发现500bp左右有稍明显的带,但是拖带很严重,所以还是失败告终。
我觉得还是模板的质量要求,明天重新手动抽RNA试试看。一切交托给命运,太悲摧了吧~
04906 ( 14:48:23)
实验室有LA,PCR仪也还不错,我想touchdown比较简略一点,引物的话已经完全按照touchdown的要求做,Tm拉高,基本也没看到缺陷,如果最终是引物问题,那rp是低到极点。至于跑胶拖带,实在找不到除了模板以外合适的说法,我想不稀释了,提纯下模板,有没有用?或者说,单从PCR的角度看,能否解释拖带的原因?如果重提RNA都出不来,那我没办法了…
yayya ( 14:49:53)
我也做RACE,但是我都不懂什么touchdownPCR,一个师兄在林科院,我就用的师兄给我的程序做的,条带是有的,但是回收之后,经过一系列处理,去测序,怎么都不是我自己要的序列,几乎都是载体
ladyhuahua ( 14:50:52)
lz,用td还要摸索条件根本没必要的,做5 race就是要多设计几对引物,然后做nested pcr,因为经常第一轮PCR都没有清晰的带,有这时间去td不如多设计引物~~
另外,race'说明书提供的方法不一定好用,首先mRNA质量要好,其次做nested pcr,成功率还是很高的
04906 ( 14:51:15)
哟西,不是这样啦,只是一些小调整,还是touchdown+nestle解决问题。
多设计引物么...我觉得设计得很好的引物假如模板是成功的话,应该可以连得上,因为引物在设计得好的基础上,成功与否关系就是模板质量和PCR的设置。盲目设一堆我觉得不如抽好一点模板。
看来程序本身没什么致命伤,就是模板让人摸不着头脑,过了这一周看看新的模板怎么样吧~~
5’end的毛病,完全非技术啊~~悲
yueban-1147 ( 14:51:47)
一般设计三对引物,因为一次PCR时候程序对结果影响很大,但是nested pcr结果就很容易出来,设计多对的好处是,没必要在第一条外侧引物上费太多时间~~
dodoit ( 14:52:15)
我也扩了N久了,同一批cDNA,其它人就能扩出来,我怎么换引物,怎么改条件都不行,真不知道是什么原因啊。。。。RP真的是低到极点了。。
seagate ( 14:52:42)
几乎都是载体?没有插入序列吗,估计是没有克隆进去,测序之前最好检测一下,或者提个质粒,用质粒作为模板再PCR一下,保证有目的片段,我建议和楼下的一样,有时间去做TD还不如多设引物,PCR是否成功关键看引物,钓基因就是一个不断摸索引物的过程,不要去执着某一对引物,试不出来就换,别给老板省钱,最终做不出来还是害了自己的毕业。
04906 ( 14:53:14)
嗯,谢谢楼上几位的意见,但是我想没有人关注模板的质量?比如消化是否会对模板有影响?或者都已经站在模板无可挑剔的情况下谈操作?但是提mRNA不一定都是绝对完美的哟。明天重新提一次,不行再重设引物。
另外有个关于3'end测序的小问题,为啥找不到polyA,其他部分都对了,难道我的序列有一部分与通用引物的序列是一样的??
测序公司说测通了,没发现问题,我的预计长度有900bp
ALALA ( 15:27:10)
啊,我最近也在做啊,用的方法是cDNA 用TdT 加dCTP尾的,一次第一轮的时候还出来了带,但是不同基因带一样大的。。。还超出了预计的大小。。。。。。因为看的到,我就没做nest,&&回收死活连不上T。。。。。。。
今天做第二次,第一轮什么都看不见,除了引物二聚体,我退火用的55度的,想着直接第二轮nest好了,现在正P着。。。
04906 ( 15:27:29)
今天重新5endRACE,继续拖带,已经重新设计引物两对...
主楼有更新,继续求教!!
koook5695 ( 15:27:49)
lz,你的RNA降解有些严重~~~
我看了你的问题。觉得有几点主要注意:
目的片段多大
5端是不是有局部高GC
有没有试过一扩和二扩都用普通PCR(非TD)
04906 ( 15:28:16)
还没跑过带出来,目的带长度未知,大约会在5~700左右。
看别的物种的确很多GC,不清楚这个的意思是指?
没有试过普通,这个关系大吗?因为我的引物tm都设到68左右的。
RNA这个...再提。
koook5695 ( 15:28:40)
可以去订个GCbuffer,对于高GC较有用,其次如果做二次可以不用设置那么高的退火,我的引物TM都在七十五以上,根据试剂盒说的,但是实际我一般是六十度退火,退火太高,影响扩增效率
04906 ( 15:31:59)
谢谢LS一直提的建议!
今天重新改过引物,把重叠序列加到500左右。这样估计目的带出来的话可能1000左右。希望可以降低错配等的几率,提高引物特异性。
另外体系也改了一下。之前一直按平常PCR做的体系(之前UPM一直加的0.2...20微升体系)
而巢式和热启动等我觉得已经针对特异性去走。
下面再跑跑,回头再发上来。
至于RNA,其实跑胶的情况和实际情况,我也说不准,尽量再完善一下吧。
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