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抗伏马菌素B_,1_单链抗体的制备
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3秒自动关闭窗口玉米中伏马菌素免疫学快速筛检方法研究--《吉林大学》2011年博士论文
玉米中伏马菌素免疫学快速筛检方法研究
【摘要】：伏马菌素(Fumonisins)主要是由串珠镰刀菌、多育镰刀菌等产生的一类真菌毒素,至今已经发现的伏马菌素及其衍生物已达20余种,其中最为主要的是B族伏马菌素中的伏马菌素B1(FB1)、伏马菌素B2(FB2)和伏马菌素B3(FB3)。FB1主要污染的食品(或饲料)是玉米及其制品,且广泛发生于世界各地。伏马菌素属于2B类致癌物质,很多动物实验已经证明其具有致癌性,有调查显示伏马菌素与人类的食管癌具有相关性。由于伏马菌素对人和动物健康的严重危害性,其在食品卫生领域中越来越受到人们的重视。目前,伏马菌素的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、免疫学检测法等。由于仪器分析方法样品处理相对复杂、成本高,限制了应用的推广。而免疫学方法具有灵敏度高、特异性好、样品处理简单、成本较低等优点,尤其适合大量样品的快速筛检。本实验在制备伏马菌素完全抗原及单克隆抗体的基础上,建立了玉米样品中伏马菌素的间接竞争ELISA(ic-ELISA)、胶体金免疫层析(GICA)和间接竞争化学发光酶免疫测定(ic-CLEIA)快速免疫学筛检方法,以期为进一步研究伏马菌素快速检测试剂产品奠定基础,满足实际检测的需求。
本文采用戊二醛法将小分子半抗原FB1分别与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)偶联制备检测抗原和免疫抗原,SDS-PAGE电泳及紫外扫描法鉴定偶联成功。常规免疫和快速免疫两种方式免疫BALB/c鼠,常规方法融合并筛选杂交瘤细胞。获得3株稳定分泌伏马菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并优选了其中的4B3细胞株,小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体。该单克隆抗体为IgG1亚类,辛酸-硫酸铵法纯化后单克隆抗体浓度为2.19 mg/mL,纯度为85.95%。抗体亲和常数为5.21×109 L/mol、效价为1:2.56×106。4B3抗体与FB2、FB3的交叉反应率分别为198%和59%;与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T2毒素、桔青霉素、赭曲霉素A、黄曲霉素B1的交叉反应率均小于10%。
利用该单克隆抗体建立了伏马菌素间接竞争ELISA检测方法,优化后的检测条件为:抗原包被浓度为0.5μg/mL,包被条件为37℃2抗体工作浓度为1:30 000; 37℃竞争反应45酶标二抗工作浓度1:5 000,作用时间37℃60底物作用时间37℃避光25间接竞争ELISA方法的线性回归方程为:y = -41.499x + 89.715,相关系数(R2)为0.981,线性范围为1.56 ng/mL～50 ng/mL,最低检出限为1.30 ng/mL;玉米加标回收实验结果表明,该方法总的平均回收率为(94.73±4.54)%、批内变异系数为8.31%、批间变异系数为8.54%;对14个玉米实际样品进行了检测,5个样品未检出FB1、6个样品中FB1的含量小于1 mg/kg、3个样品中FB1的含量在1 mg/kg～2 mg/kg之间。
柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金溶液,与伏马菌素单克隆抗体合成金标探针,组装了简易胶体金免疫层析试纸条,优化了试纸条各项参数,试纸条裸眼可视检出限为2.5 ng/mL、最佳判定浓度为30 ng/mL,试纸条稳定性可达6个月以上。加标样品测定结果显示,甲醇:水(70:30,v/v)提取的玉米样品,可直接稀释5倍后上样检测,检测结果与标准品曲线相符。14个玉米样品测定结果显示,3个样品中伏马菌素浓度不低于0.75 mg/10个样品中伏马菌素含量小于0.25 mg/1个样品中伏马菌素浓度在0.25 mg/kg～0.75 mg/kg之间。
利用该单克隆抗体建立了伏马菌素间接竞争化学发光酶免疫检测法,优化后的检测条件为:包被抗原25 ng/mL,4℃过夜;抗体使用浓度为1:100 000,37℃45酶标二抗工作浓度1:10 000,37℃60现配化学发光底物溶液,室温避光10 min。标准曲线方程为:logit (y) = 1.079 5 - 2.299 8 log (x),相关系数(r)为-0.998 2,线性范围为0.32 ng/mL～25 ng/mL,最低检出限为0.32 ng/mL。玉米加标回收实验表明,该方法总的平均回收率为(100.15±9.55)%、批内变异系数为7.90%、批间变异系数为8.12%。对14个玉米实际样品进行了检测,其中5个样品未检出FB1、6个样品中FB1的含量小于1 mg/kg、3个样品中FB1的含量在1 mg/kg～2 mg/kg之间。
利用LC-MS/MS检测方法,乙腈/水提取、伏马菌素TC-F120专用净化柱净化处理样品,对玉米样品中的伏马菌素进行了测定并与前述建立的免疫学方法进行了比较分析。LC-MS/MS方法验证结果表明,免疫学检测方法分析结果与LC-MS/MS分析结果相符。所建立的胶体金免疫层析法、间接竞争ELISA检测方法和化学发光酶免疫检测法可以用于玉米样品中伏马菌素的快速筛检。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R155.5【目录】：
摘要5-7Abstract7-13前言13-14第一篇 文献综述14-50 第1章 伏马菌素与食品安全14-26
1.1 伏马菌素的结构与性质14-16
1.2 伏马菌素的产生条件16-17
1.3 伏马菌素的毒性及危害17-19
1.4 伏马菌素的代谢19-20
1.5 伏马菌素的污染状况20-21
1.6 伏马菌素的管理21-22
1.7 伏马菌素的防控22-25
1.8 展望25-26 第2章 伏马菌素检测研究进展26-38
2.1 薄层色谱法26
2.2 气相色谱法及气相色谱-质谱联用法26-27
2.3 高效液相色谱法27-29
2.4 液相色谱-质谱联用法29-30
2.5 毛细管区带电泳法30-31
2.6 免疫学方法31-33
2.7 样品的前处理33-38 第3章 真菌毒素免疫检测研究进展38-50
3.1 酶联免疫吸附检测38-39
3.2 化学发光酶免疫分析39-40
3.3 胶体金免疫层析40-43
3.4 电化学免疫分析43-44
3.5 生物传感器44-46
3.6 荧光偏振免疫分析46-47
3.7 生物芯片47-50第二篇 研究内容50-112 第1章 伏马菌素单克隆抗体的制备50-66
1.1 材料与方法50-57
1.2 结果57-62
1.3 讨论62-65
1.4 小结65-66 第2章 伏马菌素间接竞争ELISA 检测方法的建立66-78
2.1 材料与方法66-68
2.2 结果68-75
2.3 讨论75-77
2.4 小结77-78 第3章 伏马菌素胶体金免疫层析试纸条的制备78-92
3.1 材料与方法78-82
3.2 结果82-88
3.3 讨论88-91
3.4 小结91-92 第4章 伏马菌素化学发光酶免疫检测方法的研究92-102
4.1 材料与方法92-94
4.2 结果94-100
4.3 讨论100-101
4.4 小结101-102 第5章 伏马菌素液相色谱-质谱串联检测方法的验证分析102-112
5.1 材料与方法102-104
5.2 结果104-109
5.3 讨论109-110
5.4 小结110-112结论112-114参考文献114-132导师简介及作者简介132-134在学期间所取得的科研成果134-136致谢136
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伏马菌素B1检测试剂盒规&&&&格：96T检测标本：各种动物肌肉组织、肝脏、尿液、血清、水产、蜜蜂、牛奶、粮食作物（玉米、大米、豆类、花生、麦类等）、饲料等检测方法：ELISA检测类型：酶联免疫分析法产品的用途：仅供科研究课题使用&伏马菌素B1检测试剂盒价格及详细资料：电议,或咨询在线客服QQ,或者以邮件形式发到我司邮箱&.齐一生物科技（上海）有限公司提供的ELISA试剂盒受到了广大科研单位的一致肯定和认同。大品牌保证，价格公道，倾力为国内外科研院校实验室提供最优质的产品。若有需要，我司将竭诚为您服务！&&&&&&&&&&&&&&&&&伏马菌素B1检测试剂盒本试剂盒用于测定各种动物肌肉组织、肝脏、尿液、血清、饲料等水产/蜂蜜/牛奶相关液体样本中残留的定量检测。&：&&&标本该产品本产品本产品，再与HRP标记的本产品抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物加HRP本产品450通过标准曲线中该产品试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份&封板膜2片（48）2片（96）&密封袋1个1个&酶标包被板1&481&962-8℃保存标准品：1800ng/L0.5ml&1瓶0.5ml&1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml&1瓶1.5ml&1瓶2-8℃保存酶标试剂3&ml&1瓶6&ml&1瓶2-8℃保存样品稀释液3&ml&1瓶6&ml&1瓶2-8℃保存显色剂A液3&ml&1瓶6&ml&1瓶2-8℃保存显色剂B液3&ml&1瓶6&ml&1瓶2-8℃保存终止液3ml&1瓶6ml&1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml&20倍）&1瓶（20ml&30倍）&1瓶2-8℃保存标本要求：&1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于℃保存，但应2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l弃掉，再各取50l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l，混匀后从第七、第八孔中分别取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为1200&ng/L，800&ng/L&，400&ng/L，200ng/L，&100&ng/L）。加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，晃动。温育：用封板膜封板后置37℃温育30。配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外温育：操作同3。洗涤：操作同5。显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.&终止：每孔加终止（此时蓝色立转黄色）测定：以空白空调零，50吸光。&测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项：试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。可能结晶，洗涤时不影响结果。各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后总稀释倍数（&n&5）。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。底物请避光保存。严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。本试剂不同批号组分不得混用。10.&如与英文说明书有异，以英文说明书为准。：&&&&&&&&&&稀释&&&&&&倍数&&&&&&&&&&&&稀释倍数试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。2.批内与批见应分别小于9%和11%&&&&&保存条件及有效期：1.试剂盒保存℃2．有效期：6个月伏马菌素B1检测试剂盒其它产品9017834&& &Module, shaker, complete, QIAC&& &&& &61,170.00 && &CNY9017816&& &Motor, rotary, gripper, QIAC&& &&& &6,840.00 && &CNY9017791&& &Motor, Z-drive, gripper, complete, QIAC&& &&& &8,790.00 && &CNY9017763&& &User Manual EZ1 DSP&& &&& &3,080.00 && &CNY9015210&& &Z-Module 1100&l, BR8 RD&& &&& &32,530.00 && &CNY9015180&& &Cooling Block 48-tube, 1.4 ml, M48&& &&& &4,510.00 && &CNY9015177&& &Tip Rack, M48&& &&& &20,430.00 && &CNY9015018&& &Probe 0.9mm, BR8 RD&& &&& &8,450.00 && &CNY9018095&& &QIAcube Transport Box&& &&& &35,140.00 && &CNY9017835&& &Cable, flat, shaker, 16 pol. , QIAC&& &&& &2,110.00 && &CNY9017817&& &Actuator, gripper, QIAC&& &&& &4,250.00 && &CNY9017806&& &Body, roof, QIAC&& &&& &7,490.00 && &CNY9017785&& &Board, Y, QIAC&& &&& &2,760.00 && &CNY9015183&& &Tip Loader, M96&& &&& &196.00 && &CNY9015289&& &Motor, X/Y&& &&& &50,930.00 && &CNY1030481&& &Caps forElution Microtubes(55x8),PAX,FLU&& &&& &139.00 && &CNY133003&& &NeXtalStock Methylpentanediol (200)&& &&& &1,360.00 && &CNY9243570&& &Centrifuge, PM Agreement&& &"Service response time (repair): not applicablePeriodic inspection/maintenance: yes, 1/agreement yearInspection/maintenance delivery: onsiteCost coverage for Repair Parts : not includedCost coverage for labor: yes, full coverageCost coverage for travel: yes, full coverageReplacement system (Loaner) provision: not applicableTransportation cost coverage: yes, full coverage"&& &12,900.00 && &CNY9243730&& &DML Installation and Software Training&& &"4hr. Installation and Suite Software training includes: Training Installation, Operation, and Maintenance of DML 3000DML 3000 Features, and Basic TroubleshootingSuite Software Installation and OperationNon routine FunctionsRoutine FunctionsAssay ProtocolsCreating and Measuring PlatesAnalyzing resultsAll labor, travel cost and training documentation included."&& &5,340.00 && &CNY9014380&& &Reagent Holder, micortubes and troughs&& &Holder for accommodating 8 microtubes (1.5 ml), 4 microtubes (2 ml), and 1 disposable trough (20 ml). For use with Buffers AL, AVE, and TOPE on the BioRobot MDx worktable&& &9,180.00 && &CNY9014325&& &spez. Abdeckblech Transport MWG (9194)&& &&& &1,450.00 && &CNY9018284&& &Brackets Kit, RCS 4-Plate Shaker&& &&& &32,380.00 && &CNY9018212&& &MEL sensor flag, M48&& &&& &2,620.00 && &CNY9018167&& &PCB, connect ebox, chassis, Qsym&& &&& &11,890.00 && &CNY9018162&& &PCB, connect, touch screen, Qsym&& &&& &11,050.00 && &CNY9018123&& &Tool, cable, FIW update centrifuge, QIAC&& &&& &902.00 && &CNY9018089&& &Cooling adapter, Reagent holder 2, Qsym&& &&& &7,910.00 && &CNY9017854&& &Shaker Rack Plugs (12)&& &&& &1,410.00 && &CNY9017847&& &Shaker Rack&& &&& &960.00 && &CNY9017801&& &Body, back panel, QIAC&& &&& &9,440.00 && &CNY9015070&& &EX.UNIT, Dilutor, BR)&& &&& &27,520.00 && &CNY9015016&& &Probe 0.4mm, BR8 RD&& &&& &6,840.00 && &CNY950163&& &Final Wash Reagent (DXF) (350 ml)&& &&& &647.00 && &CNY950067&& &QIAcube HT Plasticware&& &&& &3,220.00 && &CNY218600&& &miScript Precursor Assay (100)&& &Primer Assays for the detection of precursor miRNAs. Each assay will be a mix of a forward and a reverse stem loop specific primer for a specific precursor miRNA.&& &1,060.00 && &CNY218421&& &Human miScript Assay 96 SetVXX.X (20)&& &&& &81,970.00 && &CNY9018304&& &EZ1 Advanced Virus Card v1.1&& &&& &10,770.00 && &CNY9239547&& &Flag, X Stop, XY&& &&& &647.00 && &CNY9015303&& &Stopper, reagent tub, left, M48&& &&& &21,000.00 && &CNY9015293&& &Plate, magnet, M48&& &&& &76,120.00 && &CNY1031240&& &REPLI-g Midi-Reacti.Buffer(730&l/2),KG&& &&& &406.00 && &CNY1030058&& &BioSprint 15 Plasticware&& &26x 5-rod covers and 130 x 5-tube strips for the use with BioSprint 15&& &1,640.00 && &CNY&
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